中华绒螯蟹Timeless基因在不同发育阶段的表达谱分析

李 豪，李 鹏，严 洁，解文利，周开亚

(南京师范大学 生命科学学院，江苏省生物多样性与生物技术重点实验室，江苏 南京 210023)

千百年来，地球上的万物早已适应地球昼夜交替的周期性变化，从细菌到哺乳动物，几乎所有生物体内的生理活动和外在行为都表现出其自身的节律行为[1]。这种生物节律行为是生物体普遍存在的生命现象，参与多种生命活动的调控，对几乎所有生物体中的生化、生理和行为过程都产生深远的影响。最初人们猜想，这种节律行为是有机体对周围环境的变化产生的进化结果，但后来的一系列试验证明当无外界因素存在或一直处于黑暗的状态下，生物体内的各种活动依然具有一定的节律行为。由此可见，节律行为是由生物内在的生物钟所控制的[2]。

生物钟一直是人们研究的焦点之一，它是生命对地球光照以及温度等环境因子周期变化长期适应而演化的内在自主计时机制[3]，赋予生命预测时间和环境变化的能力，以协调体内的生命过程如代谢、生理和行为等[4]。生物钟机制的研究早在20世纪60年代就深入到分子水平，随着生物钟在自然界各级生物中存在的事实相继被证实[5]，与生物钟相关的基因随后也相继被分离鉴定出来。最早分离鉴定的生物钟基因是1971年Konopka等[6]用化学突变剂乙基甲磺酸处理果蝇后，在单突变染色体中发现的。至今已在哺乳动物中发现了10余个昼夜节律钟基因，分别是Period (Per1、Per2、Per3)、隐花色素(Cry1、Cry2)、Clock (circadian locomoter output cycle kaput)、Bmal1 (brain and muscle ARNT-like-1)、Timeless、NPAS2 (Neuronal PAS domain protein 2)和CK1ε (casein kinase 1 isoform ε)等[7]。其中Timeless基因是一个非常重要的时钟基因，该基因不仅对各种生物多种活动节律具有协同进化关系[8]，同时对哺乳动物胚胎及生长发育[9-12]、癌症发生发展和诊疗[13-15]等方面也发挥着重要的作用。它在动物器官发生的初期广泛表达于大脑、心脏、肝胰腺、肺、胃等器官，如果缺失该基因，则会引起胚胎致死现象[12,16]。

近些年无脊椎动物中众多物种，如埃及伊蚊(Aedesaegypti)[17]、双斑蟋(Gryllusbimaculatus)[18]、家蚕(Bombyxmori)[19]、小灶衣鱼(Thermobiadomestica)[20]等的Timeless基因研究被相继报道，其中研究最多的是果蝇Timeless基因。此外，人[21-22]及一些模式生物如小鼠(Musmusculus)[11-12,23]、斑马鱼(Daniorerio)[24-25]等的Timeless基因也有较多研究报道。目前生物钟基因研究多集中在以下3个方面：(1)发现生物钟新基因和新调节机制；(2)发现新钟控基因和钟控生命过程；(3)生物钟在医药领域的应用[4]。迄今甲壳类动物的Timeless基因研究少见报道，尤其是对甲壳动物生物钟基因在其整个生命过程中的作用还研究较少。中华绒螯蟹(Eriocheirsinensis)原产于我国北纬24°以北的中国黄海海岸水域。其自然分布于我国黄海、渤海以及东海沿海城市和内陆各省的通海河流中，是我国重要的经济蟹类，其幼体阶段包括5个溞状幼体时期和1个大眼幼体时期，从大眼幼体期开始进入淡水生活，随后生长进入仔蟹期，经多次蜕壳发育至成蟹[26]。野生的中华绒螯蟹一生有两次洄游，即索饵洄游和生殖洄游[27]。本研究通过分析中华绒螯蟹Timeless基因在成蟹、扣蟹(未性成熟)不同性别个体的不同组织中的基因表达谱，同时探究中华绒螯蟹Timeless基因在幼体不同发育阶段的相对表达情况，以了解该基因在中华绒螯蟹幼体不同发育阶段和在成蟹、扣蟹雌雄个体不同组织间的mRNA表达时相，以期为进一步研究中华绒螯蟹Timeless基因在其洄游过程中的调控作用提供基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验动物

试验用中华绒螯蟹溞状幼体Ⅰ期、溞状幼体Ⅱ期、溞状幼体Ⅲ期、溞状幼体Ⅳ期、溞状幼体Ⅴ期、大眼幼体、仔蟹Ⅰ期、仔蟹Ⅱ期、仔蟹Ⅲ期样品和扣蟹(体质量约20 g)、成蟹(体质量约100 g)样品均取自江苏南通中华绒螯蟹苗种养殖场和江苏泰州兴化中堡中华绒螯蟹养殖场。幼体不同发育时期样本分别取不超过30 mg置于加有RNA保护试剂的EP管中，用手术剪充分剪碎样品后于-20 ℃保存备用。扣蟹样品取回后在实验室养殖间饲养2周，24 h不间断充氧，室温维持在约25 ℃；日投喂食物一次，更换水一次；2周后在活泼健康的个体中随机挑选3只雌性蟹和3只雄性蟹，并分别取眼柄、肝胰腺、鳃、胃、肌肉、肠、性腺(卵巢、精巢)和心等8个组织。成蟹样品取回后直接解剖，同样取眼柄、肝胰腺、胃、卵巢、精巢等8个组织，所有组织均加RNA保护试剂并剪碎混匀，于-20 ℃保存备用。

1.1.2 仪器和试剂

三氯甲烷(南京丁贝生物科技有限公司)、RNA提取试剂盒：TransZolTMUP Plus RNA Kit(TransGen Biotech)、逆转录试剂盒：PrimescriptTMRT reagent Kit Perfect Real Time (TaKaRa)、荧光分光光度计(Thermo NanDrop 2000/2000C)、冷冻型离心机(Eppendorf 5417R)、PCR仪(Applied Biosystems VeritiTMThermal Cycler)、全自动数码凝胶图像分析系统(Tanon-3500)，荧光定量PCR仪(ABI Step One PlusTM)。所有引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2 试验方法

1.2.1 总RNA的提取与cDNA的合成

取冻存的幼体中华绒螯蟹以及扣蟹、成蟹8个组织(眼柄、肝胰腺、鳃、胃、肌肉、肠、性腺、心脏)样品，经匀浆器研磨后参照RNA提取试剂盒(TransGen Biotech)操作说明书进行总RNA的提取，经荧光分光光度计测定浓度和纯度，同时用1%琼脂糖凝胶电泳检测各总RNA的完整性。检测RNA质量可用后，取各组织总RNA量1 μg用于合成cDNA第一链，合成后的cDNA用于半定量及荧光定量试验。各组织剩余RNA均于-80 ℃超低温冰箱存放备用。

cDNA反应体系：5× Prime Script RT Master Mix (for Real Time)，4 μL；Easy Dilution (for Real Time PCR)，2 μL；Total RNA(质量浓度100 ng/μL)，1 μL；RNease Free deionized H2O，13 μL；总反应体积为20 μL。反应条件：37 ℃，15 min；85 ℃，5 s。合成的cDNA测浓度后于-80 ℃超低温冰箱存放。

1.2.2 引物设计和PCR扩增反应

采用Primer premier 5.0软件根据本课题组前期已获得的中华绒螯蟹转录组中Timeless基因序列(数据暂未发表)，设计半定量试验引物TIM-F/TIM-R以及荧光定量引物qTIM-F/qTIM-R。以中华绒螯蟹的β-actin基因作为内参并根据该基因序列设计半定量引物β-actin-F/β-actin-R。荧光定量内参引物Qβ-actin-F/Qβ-actin-R引用参考文献[28]。所有引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物信息见表1。

PCR反应体系：cDNA模板0.7 μL，上下游引物(10 μmol/L)各0.4 μL，Mix混合液10 μL，灭菌超纯水8.5 μL，总反应体积为20 μL。反应条件：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30个循环，然后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。取PCR反应产物3 μL经1%的琼脂糖凝胶电泳检测。

表1 中华绒螯蟹Timeless基因半定量和荧光定量表达分析所用引物

1.2.3 实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测

成蟹和扣蟹时期组织的Timeless基因表达量检测：根据设计好的引物(表1)对两个时期样本的各组织(眼柄、肝胰腺、鳃、胃、肌肉、肠、卵巢/精巢、心脏)中Timeless基因的表达情况进行检测。本试验样品和内参均设计了3次生物学重复和3次技术重复。荧光定量PCR反应体系为20 μL：SYBR®Premix Ex-TaqTMⅡ(2×)，10 μL；上游引物和下游引物(10 μmol/L)，各0.8 μL；ROX Reference DyeⅡ(50×)*3，0.4 μL；cDNA模板(总量约80 ng)，1.0 μL；双蒸水，7 μL。反应程序95 ℃，30 s；然后进入40个循环：95 ℃，5 s；60 ℃，30 s；最后95 ℃，15 s；60 ℃，1 min；95 ℃，15 s。反应结束后将荧光定量PCR检测结果导出。

幼体不同发育阶段的Timeless基因表达量检测：用同样的方法和PCR程序检测中华绒螯蟹Timeless基因在其9个不同发育阶段(溞状幼体Ⅰ期、溞状幼体Ⅱ期、溞状幼体Ⅲ期、溞状幼体Ⅳ期、溞状幼体Ⅴ期、大眼幼体、仔蟹Ⅰ期、仔蟹Ⅱ期和仔蟹Ⅲ期)的表达情况。

1.2.4 数据统计分析

导出的试验数据采用2-ΔΔCt方法[29]计算目的基因mRNA的相对表达量并作图，成蟹和扣蟹时期将精巢和卵巢组织中Timeless基因的相对表达量设定为参照，幼体的9个发育阶段将溞状幼体Ⅰ期的Timeless基因相对表达量设定为参照。用SPSS 21.0软件进行单因素方差分析和LSD法多重比较，采用平均值±标准差表示，显著性由t检验得出，显著性水平为α=0.05。成蟹和扣蟹的不同组织间及幼体不同时期间P<0.05表示为基因表达差异显著(图表中用*表示)。

2 结果与分析

2.1 Timeless基因的半定量试验分析

PCR反应结束后，经琼脂糖凝胶电泳检测，获得长度约250 bp的片段，然后回收目的产物，并用引物qTIM-F/qTIM-R对PCR产物进行测序。结果验证了该基因的正确性。

2.2 荧光定量试验分析

经荧光定量PCR分析，Timeless基因广泛地表达于中华绒螯蟹幼体不同的发育阶段以及成蟹、扣蟹的不同组织中。

2.2.1 成蟹、扣蟹不同性别、不同组织间的Timeless基因表达差异分析

以qTIM-F/qTIM-R为目的基因引物，Qβ-actin-F/Qβ-actin-R为内参基因，采用荧光定量PCR技术检验中华绒螯蟹Timeless基因在扣蟹和成蟹时期不同性别的眼柄、肝胰腺、鳃、胃、肌肉、肠、性腺、心脏8种组织间的表达情况，结果见图1、图2。以性腺(精巢、卵巢)组织的mRNA表达量为参照，无论是雌蟹还是雄蟹，在扣蟹时期，Timeless基因都是在肝胰腺和肌肉组织中的表达量最高，与其他组织表达均呈显著差异(P<0.05)，在眼柄、鳃、胃、肠和性腺的表达量次之且相对较为接近，在心脏中的表达量最低。而在成蟹时期，Timeless基因仅在肝胰腺中的表达量最高，与其他各组织表达均呈差异显著(P<0.05)。且在该时期的雄性个体中，Timeless基因在除肝胰腺外的其他7个组织中表达量接近，而雌性的其他7个组织中表达量则稍微有些差异，但差异不显著。

值得注意的是扣蟹时期不同性别之间的组织表达无显著差异(P>0.05)，而成蟹时期Timeless基因在不同性别相同组织间的表达差异显著：在眼柄组织中，雌蟹Timeless基因表达量明显高于雄蟹(P<0.001)；而在肌肉、肠、心脏3个组织中，雄蟹的Timeless基因表达量也显著高于雌性的基因表达量，雌雄个体间肌肉组织中Timeless基因表达存在极显著差异(P<0.01)，在肠和心脏中表达呈显著差异(P<0.05)。

图1 中华绒螯蟹Timeless基因在雌、雄成蟹不同组织中的mRNA表达情况1：眼柄；2：肝胰腺；3：鳃；4：胃；5：肌肉；6：肠；7：性腺(卵巢、精巢)；8：心脏.不同小写和大写字母分别表示雌蟹和雄蟹中表达量的差异水平显著(P<0.05)；内参基因：β-actin；n=3；*为P<0.05，**为P<0.01，***为P<0.001.下同.

图2 中华绒螯蟹Timeless基因在雌、雄扣蟹不同组织中的mRNA表达情况

2.2.2 Timeless基因在幼体不同发育阶段的表达差异分析

用同样的引物和方法对中华绒螯蟹Timeless基因在幼体9个发育时期的mRNA表达情况进行了检测(图3)。以溞状幼体Ⅰ期的基因表达量设为参照，发现从溞状幼体Ⅰ期到溞状幼体Ⅳ期Timeless基因的表达量基本呈稳步上升趋势，但增幅不大，至溞状幼体Ⅴ期时表达量突然激增，达到了最高值，与其他发育时期均呈显著差异(P<0.05)。然后在大眼幼体时期的表达量又急剧下降，达到最低值，之后在仔蟹时期的表达量又呈稳步上升趋势。

3 讨 论

Timeless基因是重要内源性的生物钟基因之一，在生物体内周期性表达，对生物节律、细胞周期、胚胎发育、癌症发生发展和诊疗等发挥着重要的生物学作用。本研究采用实时荧光定量PCR分析了中华绒螯蟹Timeless基因在幼体不同发育阶段及在扣蟹、成蟹不同性别个体不同组织中的表达情况。

现已证实，多种外周组织如心、肝、肾、骨骼肌，乃至体外培养的细胞中均有生物钟基因的表达[30-36]。本研究检测发现，Timeless基因无论在中华绒螯蟹幼体发育时期还是在扣蟹、成蟹不同性别个体的眼柄、肝胰腺、鳃、胃等8个不同组织中均有表达，这与Timeless基因在其他动物中的表达情况类似。

图3 中华绒螯蟹Timeless基因在幼蟹不同发育时期的mRNA表达情况1：溞状幼体Ⅰ期；2：溞状幼体Ⅱ期；3：溞状幼体Ⅲ期；4：溞状幼体Ⅳ期；5：溞状幼体Ⅴ期；6：大眼幼体；7：仔蟹Ⅰ期；8：仔蟹Ⅱ期；9：仔蟹Ⅲ期.

3.1 Timeless基因在成蟹、扣蟹时期的作用

从酵母到人类，生物钟和能量代谢都存在着紧密的偶联关系[37]，在本研究中发现，在扣蟹时期无论是雌性个体还是雄性个体，Timeless基因在肝胰腺组织和肌肉组织中的表达量均较高，在其他几个组织中表达量较低，到成蟹时期Timeless基因主要在肝胰腺大量表达。众所周知，肝胰腺是十足目甲壳类动物脂类储存和脂类加工的主要器官[38-40]，其脂质含量高，脂类新陈代谢十分旺盛，是能量提供和代谢的中心，对甲壳动物的生长和发育以及生殖都有着重要的作用，而Timeless基因在肝胰腺组织中高量表达表明该生物钟基因在中华绒螯蟹新陈代谢过程中起着十分重要的作用，也表明其参与了中华绒螯蟹的生长和发育。中华绒螯蟹的扣蟹至成蟹时期是生殖洄游的关键阶段，大眼幼体以及尚未性成熟的幼蟹溯河上迁，幼蟹一面上迁，一面不断地觅食、生长和发育；幼蟹中一部分侵入江河的支流、沟渠以及湖泊等较浅的水域里生活，另一部分则分散到江河的沿岸带，并继续上迁，一直可持续到夏季[27]，这需要强有力的肌肉和能量支持。幼蟹在上迁过程中经多次脱皮才完全变为成蟹的形状并达到成熟，一般到第二、三年成熟，再洄游到河口交配产卵，产卵后的亲蟹即老死在海中[41]，幼体的上迁完全受其自身新陈代谢的调控。中华绒螯蟹洄游过程中肌肉收缩、生殖腺生长合成新的物质等需要不断地消耗大量能量，例如上迁过程中，幼蟹要适应渗透环境变化而消耗能量，幼蟹逆流而上爬越闸、坝、堤以及鱼栅等多种障碍亦需消耗大量能量。Timeless基因在肝胰腺和肌肉组织中的高量表达说明该时钟基因在中华绒螯蟹生殖洄游过程中对其运动的调控起重要作用。另外肌肉与肝胰腺组织一样是重要的储能组织，该基因在这两个组织的高量表达也与这两个组织的理化性质特性相一致。中华绒螯蟹成蟹性成熟后可借助水流，顺流而下，赴河口浅海交配生殖[27]，这时期其肌肉受到的选择压力大大减少，贾小燕[42]的研究表明，中华绒螯蟹雌性亲蟹在生殖洄游过程中主要以脂肪作为供能物质，本研究中发现中华绒螯蟹Timeless基因在成蟹肝胰腺组织中的表达量极显著高于在其他组织的表达量也进一步表明Timeless基因在肝胰腺供能过程中发挥重要作用。

3.2 Timeless基因在中华绒螯蟹幼体发育时期的作用

中华绒螯蟹从胚胎开始至溞状幼体期都生活在咸淡水中(盐度约20)，然后在溞状幼体后期至大眼幼体，幼蟹会从生活盐度较高的海水逐渐调节至淡水环境生活，在此过程中中华绒螯蟹幼体会经过变态发育不断蜕皮生长，在大眼幼体期经历渗透压生理适应，并逐渐适应淡水生活。本研究中发现中华绒螯蟹Timeless基因在幼体9个发育时期均有表达，且该基因在溞状幼体前4个时期的表达量相近并呈稳步上升趋势，这些发育时期间的Timeless基因表达差异显著，其在溞状幼体Ⅴ期mRNA表达激增，但在大眼幼体期表达又显著下降，然后其在仔蟹时期的表达又呈稳步上升趋势。已有研究表明哺乳动物Timeless基因与其生长发育和细胞发育周期有关[9-12,43-44]。其中Xiao等[9]的研究表明，在哺乳动物胚胎发育时期，Timeless基因的功能高度保守，在器官发生的初期，该基因广泛表达于大脑、肺、心脏、肝、胃和尿生殖嵴等器官，同时还发现Timeless表达水平的动态变化对肺的发育是至关重要的。Li等[10]研究表明，Timeless基因在小鼠上皮形成、肾发生和其他上皮器官形成中有重要作用。而Liu等[45]在黑腹果蝇中的研究结果表明，Timeless基因对在果蝇的生长调控也起重要的作用，消除该基因将会引起总睡眠的减少及中断，从而进一步影响果蝇的生长发育，以及繁殖和存活能力等。这些试验与本研究都表明Timeless基因在不同物种的幼体发育时期具有重要的生理调控性。

3.3 小结

总之，越来越多试验证据表明生物钟系统在各种生命基本过程起到不可或缺的调节作用，其系统中的关键基因Timeless尤为重要。在本研究中，中华绒螯蟹Timeless基因在不同发育阶段以及性成熟的扣蟹、成蟹不同组织间的这种独特表达模式，初步表明该基因参与了中华绒螯蟹的幼体生长发育和细胞发育及生理适应调控，具体的作用还需要进一步研究验证。

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