人类微量精子冷冻方法的研究进展

邵帅，洪乐鹏，江梅，丁涛，姜经航，曹玉平，蔡丽丽，邓艳琴

(1.湖北省荆门市第二人民医院生殖医学科，荆门 448000；2.广州医科大学人体解剖教研室，广州 511436；3.湖北省荆门市第二人民医院妇科，荆门 448000)

世界范围内由于男性不育问题导致的不育大约占40%～50%[1]，而无精子症大约占男性不育问题的10%，影响着全世界1%的男性人群，而且无精症的发生率会逐渐升高[2]。无精子症患者在以前是无法拥有自己遗传学意义上的孩子，而随着辅助生殖技术的发展，无精子症患者可以通过经皮附睾精子抽吸术(PESA)、睾丸切开取精子术(TESE)、显微睾丸切开取精术(MESE)等技术来获取少量的精子[3]，再通过卵胞浆内单精子注射(ICSI)将精子注射到卵母细胞中，最后将形成的胚胎移植到女性宫腔内获得临床妊娠。无精子症患者通过PESA、TESE、MESE等手术取精和ICSI相结合的技术成功生育的报道早已屡见不鲜[4-5]。对于无精子症患者来说，通过手术获取的少量精子不仅意义重大，而且也极其珍贵，而在ICSI后保存剩余的精子不仅可以避免多次手术取精导致的血睾屏障受损以及性功能损害，而且还可以减轻患者的心理压力和经济负担[6]。

常规精液冷冻保存程序中离心和清洗不仅会导致精子的丢失而且容易造成精子损伤，研究显示常规精液冷冻睾丸精子的复苏回收率只有1%[7]，所以不能用于微量精子的冷冻。除此之外，手术取精获得的精子数量少，精子头部DNA不够稳定，细胞膜也未成熟完全，所以常规方式冷冻效果很差。因此，找到合适的冷冻方法以及合适的冷冻载体，提高微量精子冷冻后的复苏率、存活率就显得极其重要。本文就近年来人类微量精子冷冻方法(空透明带冷冻、液滴冷冻、Cryoloop冷冻、麦管冷冻法等)作一综述。

一、空透明带冷冻

透明带是包绕在卵母细胞外的一层糖蛋白，在卵子发生、卵子保护、阻止多精受精中发挥着重要的作用[8]。运用显微操作技术清除透明带内容物，然后用ICSI显微注射针将少量精子注入到空透明带内。显微操作处理时可以通过激光破膜或者机械破膜，留在透明带上孔的大小也会影响精子冷冻，小孔会增加遗留宿主DNA片段的风险，而这些DNA片段会粘附到精子上，并随着ICSI注射到卵母细胞内，引发伦理学争议；大孔可以将胞质内容物清除干净，但也容易造成精子丢失，用石蜡油封口时会降低解冻复苏后精子的回收率[9]。有研究表示将含有卵黄和甘油的冷冻保护剂在精子注射前预先填充到卵母细胞内能够防丢失，而且有很好的冷冻的效果[10]。

空透明带冷冻可以明显提高精子冷冻复苏回收率，维持精子的运动性、染色质和DNA完整性[11]，研究显示透明带冷冻精子冻融回收率为88.3%，ICSI活动精子的受精率达到60%[7]，说明空透明带冷冻对精子的损伤较低，可以为微量或单个精子的冷冻提供很好的保护。Walmsley等[12]报道1997年诞生了第一例用空透明带冷冻睾丸精子受精成功的婴儿，5个周期中3个怀孕，并且其中的2个为双胞胎。该报道3年后也有研究用人的空透明带冷冻单个附睾精子同样获得妊娠[13]，这对于稀少或单个精子来说是极好的冷冻方法。

空透明带的来源为人和动物的透明带(主要为小鼠和仓鼠透明带)，人的透明带冷冻精子的冻融回收率和受精率均低于小鼠透明带冷冻，这与人类精子容易和透明带上的ZP3结合发生顶体反应有关[13]。尽管透明带冷冻的复苏回收率在75%以上，但仍然存在一些问题，比如人的透明带来源比较受限，动物来源的透明带容易和人类精子相互作用受到一定的伦理争议，两者均无法避免外来异源性蛋白污染，而且受到法规和伦理问题的限制。

二、微滴冷冻法

1.快速微滴冷冻法：将含有精子和冷冻保护剂混悬液的液滴滴在培养皿或冷冻管里，液滴上覆盖矿物油，待培养皿或冷冻管放在液氮上熏蒸后，投入液氮中冷冻保存，该法冷冻回收率比较好。Bouamama等[14]用ICSI将100个精子和冷冻保护剂(CPA)制成0.5 μl的液滴保存在覆盖有石蜡油培养皿中，将培养皿用封口膜封好后放在液氮蒸汽上熏蒸2个小时再放到液氮中，解冻后精子的回收率为100%，运动率为50%。张静静等[15]通过比较快速微滴冷冻法和常规冷冻法，发现冷冻后精子的活力、DNA损伤之间无统计学差异。

快速微滴冷冻也可以用于单个精子冷冻，Quintans等[16]将4～6个精子与CPA混匀保存在覆盖有石蜡油培养皿的液滴中，将培养皿用封口膜封好后水平冷冻在液氮罐中，解冻后发现其精子的回收率为90%～100%。其他研究运用相同的技术保存睾丸穿刺的精子，冷冻后精子的回收率为100%，解冻后67%的精子保持冷冻前的活力，ICSI后51个卵中9个受精，移植3个后其中的1个获得妊娠[14，17]。

2.微滴玻璃化冷冻法：另一种方法是直接将精子和冷冻保护剂或者不加冷冻保护剂的液滴入液氮凝固成微滴，然后收集到冷冻管中，最后将冷冻管中投入液氮储存保存。该方法精子冻存体积小，不会粘附载体，精子回收率成效显著。Isachenko等[18]研究发现将精子和冷冻保护剂混匀后以30 μl 每滴滴入液氮中，然后收集到冷冻管中投入液氮保存，结果显示：与不加冷冻保护剂相比，加冷冻保护剂组的解冻后精子存活率较高，且能保护线粒体膜电位；而马超等[19]通过超快速冷冻比较冷冻保护剂对人类微量精子冷冻的影响，发现添加冷冻保护剂和不添加冷冻保护剂的精子解冻后回收率、存活率以及活动率均无统计学差异。葛斌等[20]通过比较无保护剂的微滴玻璃化冷冻法和慢速冷冻法，发现两种冷冻方法受精率、卵裂率、妊娠率和流产率均无统计学差异，但优胚率高于慢速冷冻；梗阻性和非梗阻性精子微滴法冷冻复苏率均大于60%，精子复苏后女方的妊娠率均为40%[21]。

不管是快速微滴冷冻法还是微滴玻璃化冷冻法都有一定的局限性，微滴直接滴入液氮中，容易增加交叉污染的风险，而在培养皿中保存微滴冻存时容易受到尺寸大小的影响而导致保存的不便。

三、Cryoloop冷冻

Cryoloop由冷冻盖、管、不锈钢杆和尼龙环组成，利用虹吸原理可以将少量的精子保存在尼龙环上。Cryoloop一开始用于胚胎的冷冻，之后才用于稀少或单个精子的玻璃化冷冻。Schuster等[22]和Desai等[23]将Cryoloop和常规慢速冷冻结合起来保存极少量的精子，发现Cryoloop法解冻后精子丢失非常少，可以忽略不计。Desai等[23]用该方法评估精子的功能时发现将保存在Cryoloop上的精子解冻后注射到人的卵母细胞内，卵母细胞能够正常对精子的头部去凝缩，并且有原核形成。

Desai等[23]认为Cryoloop可以可替代仓鼠透明带来冷冻单个精子，用ICSI针将精子直接放到冷冻保护剂形成薄膜的尼龙环上保存，精子解冻后与常规载体冷冻保存者无明显差异，单个精子冷冻后精子活力达73%；将2～8个附睾精子和睾丸精子装载到尼龙环上进行液氮蒸汽熏蒸后放入液氮中保存，解冻后精子回收率为72%，解冻后精子头部轻微摆动，但是尾部摆动比较灵活，附睾和睾丸的精子注射到卵母细胞内均获得受精卵。也有研究发现Cryoloop冷冻可以保持精子头部染色质浓缩以及完整性[24]。

Cryoloop作为一种非生物性载体比较安全，可以解决许多空透明带冷冻带来的问题，精子和尼龙环接触面积比较小可以阻止精子粘附，而且省去了离心步骤，可以最大限度保存精子，说明Cryoloop对于冷冻极少量的精子是非常有用的载体。Cryoloop最大的缺陷就是一种开放性储存系统，精子直接与液氮接触，增加了交叉污染的风险。

四、麦管法冷冻

微型麦管法是用胚胎冷冻麦管在无菌条件下切成2.5 cm长的部分，一端用塑料塞封闭，将15～20 μl的精子混悬液通过显微操作针注射到微型载杆中，另一端也用塑料塞封闭。5～6个微麦管放到冷冻管中，冷冻管在液氮蒸汽上熏蒸30 min后投入液氮保存。ICSI时只需解冻冷冻管中的一个微型载杆，并不影响剩余的微型载杆冷冻，也不影响精子的活力和受精率[25]。王乃辉等[26]比较了超微量冷冻麦管与1.8 ml冷冻麦管和0.25 ml冷冻麦管，发现超微量冷冻麦管能够明显提高睾丸精子的冷冻复苏率。

Vicdan等[27]使用常规麦管法冷冻TESE获取的克氏综合征患者的精子与新鲜精子比较，发现两者的受精率分别为48.3%和52.7%，而临床妊娠率分别为60%和51.6%，两者均能获得相同的妊娠率。Isachenko等[28]使用常规冷冻麦管和拉细开放式冷冻麦管来冷冻0.5 μl的精子悬液，为形成封闭式冷冻系统，防止液氮中交叉污染，将拉细开放式冷冻麦管放入另一个90 mm的麦管中变成封闭性载体。吴颖等[29]应用MAPI 系统将精液分装到CBS高安全性麦管中，不仅不影响冷冻效果，而且能够防止交叉污染，特别适用于稀少精子保存。鉴于开放式麦管的不安全性，封闭式冷冻麦管随之诞生，2012年Desai等[30]用一种封闭式冷冻麦管HSV通过慢速冷冻来保存附睾或睾丸的微量精子，解冻复苏后精子回收率为33%～100%，ICSI 注射到6个成熟卵中均获得受精，移植后成功妊娠。该方法能够避免精子与液氮以及其他物质接触，可以防止交叉污染。使用麦管作为载体冷冻少量精子简单有效，而且容易操作。目前麦管适合冷冻少量的精子，并不适合冷冻严重损伤或者未成熟精子，由于该方法冷冻时精子容易粘附到管壁上造成精子丢失，更不适合冷冻单个精子。

五、显微操作针法冷冻

使用ICSI 针作为无菌载体来冷冻单个精子早已被提及和建议[30]。Sohn等[31]使用ICSI 针来冷冻少弱精子症患者的精子，慢速冷冻和超快速冷冻方法解冻后精子的回收率分别是90.1%和79.6%，存活率分别为28.8%和8.2%。Kuznyetsov等[32]比较了极体活检针和拉细麦管的微量精子冷冻效果，结果显示冷冻复苏后极体活检针和拉细麦管的精子复苏率分别为87%和73%，极体活检针冷冻有明显的优势。使用显微操作针作为载体来冷冻单个精子简单有效，但是不适合长期保存，因为显微操作针针尖比较脆，容易破碎，而且精子容易直接暴露在液氮中，增加了交叉感染的风险。

杨志勇等[33]用快速冷冻和液氮熏蒸来比较剥卵针冷冻微量精子的冷冻效果，将精子装载到剥卵针里，矿物油封闭载体两端，快速冷冻(将剥卵针直接投入液氮中保存)和液氮熏蒸(将剥卵针在液氮蒸汽熏蒸30 min后投入液氮保存)冷冻精子的复苏率分别为(55.9±11.0)%和(36.3±9.8)%，精子活力分别是(36.64±8.7)%和(23.48%±6.2)%，该方法简单、有效，可以避免液氮中交叉污染。

六、团藻球

团藻球是由团藻藻类聚集形成的球形菌落，用持卵针固定球形结构，用ICSI 针将活动精子注射到球形结构中，将包含精子的团藻球置于冷冻保护剂中后装载到麦管中，麦管经液氮蒸汽熏蒸后投入液氮保存；解冻麦管后，用ICSI 针将精子从团藻球中取出。尽管解冻后精子的回收率为100%，活力约为60%[34]，该冷冻方法还是存在一定的缺陷：精子暴露在藻类的生物材料中，ICSI时容易将粘附在精子上的生物材料注射到卵母细胞内。而美国食品和药物管理局新的规定以及欧盟组织指令规定非人体的生物材料的团藻不能用于临床，这使得用团藻球冷冻精子受到极大的限制。

七、琼脂糖微球

琼脂糖微球是用2%的琼脂糖微球作为一种非生物的类似的透明带。预先将少量精子在冷冻保护剂中平衡，通过显微操作将精子装载到每个琼脂糖微球中，然后琼脂糖微球装入塑料麦管中，最后麦管经液氮蒸汽熏蒸后投入液氮保存。Hatakeyama等[35]将26位男性的2 142条活动的精子置于702个琼脂糖微球中进行冷冻保存，解冻后63%精子保持活力，精子活动率为20%～95.1%。而在琼脂糖微球冷冻单个精子时，分别将微球放在聚碳酸脂板和金属片上进液氮熏蒸，两者的精子回收率分别为91.5%和98.3%，精子存活率分别为97.3%和91.4%，均表现出优异的冷冻效果[36]。琼脂糖微球作为冷冻少量精子的新型非生物载体，可以作为一种潜在临床应用的载体。

八、坚硬表面玻璃化法(SSV)

坚硬表面玻璃化法将少量的精子和冷冻保护剂(CPA)混匀，取50 μl或100 μl的精子混悬液装在毛细管中，在干冰表面或冷冻的金属表面进行迅速降温形成冰冻的小液滴，然后转到液氮中保存。SSV法迅速降温可以防止细胞内冰晶的形成，由于玻璃化过程发生在毛细管内，可以保证精子的迅速解冻。Satirapod等[37]研究显示SSV法与慢速冷冻相比，精子活力、能动性无显著差异，但SSV法中的精子DNA损伤率和尾部缺陷明显少于慢速冷冻法。Gil-Salom等[38]成功应用这种方法保存睾丸精子，解冻后通过ICSI授精，发现其临床妊娠率以及移植率与新鲜睾丸精子的效果一样。

九、Cell Sleeper法

Cell Sleeper作为一种非生物活性的新型冷冻载体，被证明是一种潜在的非常适合冷冻单个精子的载体。Endo等[39]将精子保存在Cell Sleeper中进行玻璃化冷冻，复苏后回收率为83%，通过ICSI将精子注射到6个卵母细胞中，5个形成原核，胚胎形成率为100%，移植后成功分娩。Endo等[40]在接下来的研究比较了Cell Sleeper和 Cryotop法的冷冻效果，发现两组之间的精子能动性和活力均无显著差异。Coetzee等[41]将无精子症患者的单个睾丸精子保存在Cell Sleeper中进行快速低温冷冻，解冻后注射到卵母细胞中，179个卵母细胞的受精率为 65.9%，每个周期的妊娠率为58.3%，其中4个周期妊娠并继续妊娠超过20周。

微量精子冷冻技术的运用为少弱精子症以及无精子症患者提供了极大的帮助，增加了他们生育的希望和信心。除了上述冷冻方法，还有Cryotop、海藻酸滴法、薄片法、新冷冻片法等。虽然在冷冻方法上已取得了一定的进展，但这些方法在冷冻时或多或少都存在一定的缺陷，需要考虑保持精子的DNA完整性以及避免线粒体膜损伤等，这就需要更多的实验研究来探寻合适的冷冻方法、载体以及冷冻保护剂等，从而达到简便方便、回收率高、精子完整性好以及无交叉污染风险的微量精子冷冻方法。