CRISP1在性腺中的定位和表达及其生殖调节功能的研究进展

黄小烜，罗金，穆杨，徐望明

(武汉大学人民医院生殖医学中心，武汉 430060)

哺乳动物精子在进入雌性生殖道后，需要经历获能、顶体反应、精卵质膜融合等一系列事件才能使卵子受精，随着基因敲除技术的发展，已经发现了许多在受精过程中起到关键作用的分子，其中就包括富含半胱氨酸分泌蛋白1(cysteine-rich secretory protein 1，CRISP1)[1]。有大量的体外实验和基因敲除模型研究显示，附睾内的CRISP1参与了精子获能、精子-透明带结合及精卵融合的调控[2-4]。基于以上研究结果，CRISP1被认为是目前在避孕干预中一个具有前景的靶点，有望在此基础上开发出安全有效且可逆的男性避孕疫苗[5]。本文就CRISP1在不同物种性腺中的定位、表达研究成果及其在精子获能、精子-透明带结合及精卵融合等生殖调节中的作用进行综述。

一、CRISP1的表达及定位

Cameo等[6]最早在1976年通过聚丙烯酰胺凝胶电泳发现了仅由大鼠附睾分泌的蛋白CRISP1，这种蛋白有两种形式，被分别称为D蛋白和E蛋白，其由附睾头部近端的上皮细胞以雄激素浓度依赖性方式合成，并分泌到附睾管腔中[7]。人CRISP1由Hayashi等[8]于1996年发现，与啮齿动物CRISP1有一定的相似性。目前对CRISP1的研究大部分仍集中于啮齿动物，而对人CRISP1探索较少。

精子在附睾成熟的过程中，CRISP1与精子表面结合，在精子进入雌性生殖道后发挥作用[7]。在对大鼠的研究中，CRISP1最初定位于精子头部顶体区域，随着顶体反应的发生，两种形式的蛋白定位会发生改变：分子量较大的D蛋白以松散、可逆的方式结合在精子表面，当精子离开附睾进入雌性生殖道后，D蛋白会从精子表面释放；而分子量较小的E蛋白同精子表面紧密结合，随着顶体反应的发生E蛋白仍结合在精子表面，并迁移到精子头部的赤道板区域[9]。CRISP1与精子结合的机制仍然未知，但有研究显示Zn2+能与CRISP1形成CRISP1-Zn2+复合物并参与CRISP1与精子在附睾成熟过程中的松散结合，而CRISP1与精子的紧密结合机制被认为可能与附睾小体有关[7]。但CRISP1与精子结合的机制还有待进一步研究。

随着对CRISP1研究的深入，可以发现，CRISP1的表达及定位在不同物种之间有差异。对绒山羊CRISP1在睾丸和顶体反应前后的精子表面定位的研究中，研究者发现CRISP1在绒山羊睾丸组织中广泛表达，但主要集中在生精小管内侧中央区，晚期精子细胞富集区域；CRISP1在精子表面的定位也随着顶体反应的发生而改变，但顶体反应前CRISP1主要定位于精子尾部与头部的连接处，顶体反应后CRISP1主要定位于精子头部的赤道板区域[10]。对于CRISP1在人性腺组织中的表达及定位，各项研究结果并不一致，有研究显示人CRISP1只在附睾分泌[11]，而另一个研究显示在人类输精管和精囊中也有CRISP1基因的表达[12]。另外，与大鼠CRISP1仅由附睾头部近端的上皮细胞分泌不同，Leir等[13]对成人附睾上皮细胞以附睾头部、体部和尾部分段进行了原代培养，经检测后发现，附睾头部、体部和尾部均有CRISP1的表达，且各部分表达量相当。

二、CRISP1的功能

CRISP家族蛋白有三个潜在功能结构域：N末端的PR结构域、C末端的ICR结构域和铰链区结构域，ICR结构域和铰链区结构域也被合称为CRD结构域[14]。PR结构域可能介导CRISP1参与精卵融合，CRD结构域可能介导CRISP1的抑制获能功能[15]。

1.调节精子获能：精子获能是哺乳动物受精的重要步骤，而酪氨酸磷酸化是获能最重要的过程之一[16]。有研究显示，在大鼠中CRISP1以浓度依赖性方式抑制酪氨酸磷酸化，从而抑制精子获能，这种抑制作用是可逆的，可以通过外源性cAMP来克服，表明CRISP1等可能通过控制精子质膜表面的某些离子通道，在获能早期产生抑制作用[17]。有研究显示，CRISP1以浓度依赖性方式瞬时结合于精子表面，在与其抑制获能活性一致的浓度范围内，这种结合是饱和的[18]，这也证实了CRISP1抑制精子获能的浓度依赖性。Da等[19]对小鼠进行CRISP1基因敲除，显示获能期间在突变体精子中酪氨酸磷酸化水平明显低于对照组。而最近Hu等[20]对小鼠进行基因敲除后，结果显示仅CRISP1缺陷并没有改变获能精子的百分比及酪氨酸磷酸化水平。有研究者认为产生这种差异的原因可能是实验小鼠遗传背景不同导致了生殖表型不同[21]。CRISP1对精子获能产生的影响可能还需要进一步的验证。

2.参与精卵间相互作用：对CRISP1基因敲除小鼠进行体外受精的检测中，突变体精子穿过透明带完整或无透明带的卵子的能力显著降低，表明在缺乏CRISP1的情况下，精子穿过透明带和与卵融合的能力降低[19-20]。在大鼠中，如前述，两种形式的CRISP1，E蛋白与D蛋白的作用机制不同，E蛋白会随着顶体反应的发生，定位到精子头部的精卵融合区域上，参与精卵融合[2]。CD9是已知的卵细胞膜上介导精卵融合的精子结合位点[22-23]，有研究显示在灵长类动物中，CRISP1能与CD9相互作用，促进精卵融合，但具体作用机制仍不明确[24]。此外，CRISP1也参与了精子与透明带的结合，且作用在结合的初始阶段[7]。CRISP1参与精卵间相互作用的过程可以概括为：位于精子顶体区域的CRISP1与透明带结合，诱导精子发生顶体反应，紧密结合于精子表面的CRISP1(E蛋白)迁移到精子头部的赤道板区域，通过与卵子表面的精子受体结合，启动精卵融合。

对人CRISP1功能的研究显示，将人精子与抗CRISP1抗体共同孵育一段时间后，人精子穿透仓鼠卵子的能力显著降低，并呈现浓度依赖性，而抗CRISP1抗体对人精子的活力、顶体反应的发生及精子与仓鼠卵的结合并无显著影响，CRISP1可能通过与人卵子表面的特异性CRISP1结合位点结合参与精卵融合[4]。有研究显示，CRISP1能通过与人类重组蛋白ZP3以浓度依赖性方式相互作用参与到精子-透明带结合的起始阶段[25]，ZP3是透明带上与人精子结合的最主要位点[26]，因此，同啮齿动物一样，CRISP1既参与了精卵融合，也参与了精子-透明带结合。CRISP1在人受精过程中的这些功能被认为是与精子紧密结合的CRISP1部分的功能[27]，而与精子松散结合可溶于精浆的CRISP1在精液中的作用仍有待确定。

3.调节精子的运动及方向：近年来有对基因敲除小鼠的研究显示CRISP1也存在于雌性配子中，由卵丘细胞表达，并可以通过抑制精子的过度活化和增强精子的线性泳动来调节精子的运动及方向[28]。最新的研究显示，CRISP1基因敲除小鼠的精子运动速度会下降[20]。

4.可作为无精子症的诊断标志物：有研究发现，梗阻性无精子症患者精液中CRISP1水平显著低于非梗阻性无精子症患者精液和正常精液中CRISP1水平，研究者认为男性生殖道任何部位的梗阻都可能导致精液中CRISP1水平的降低，因此CRISP1对于区分梗阻性和非梗阻性无精子症有相当大的诊断能力，可作为不同类型无精子症的诊断标志物[29]。

三、CRISP1作为避孕的靶点

目前国内外对于CRISP1的研究，在动物试验中主要研究了CRISP1的表达定位及其在受精过程中的作用，结果表明CRISP1满足作为避孕靶点的许多必要条件：①它是附睾特异性蛋白；②影响生育力；③它在精子获能及精卵融合中起特定作用；④它的活性位点已被鉴定；⑤人类生殖道也具有同源的CRISP1[30]。有研究显示，用天然或重组大鼠CRISP1对动物进行免疫，在超过90%的动物中产生了针对CRISP1的特异性抗体，并且这种抗体对动物生育力的抑制作用是可逆的[7]。本课题组前期构建的pcDNA-mCRISP1 DNA疫苗，使免疫后的雌/雄性小鼠均产生了特异性的抗体，并诱导一定的抗生育反应[31-32]。进一步的研究表明，免疫产生的小鼠CRISP1特异性抗体对正常雄性小鼠附睾精子的活动力和存活率、自发或诱发顶体反应发生率无显著影响，也不会引起精子的凝集反应及影响精卵黏附，但当抗体浓度达到一定水平时，受精率会显著下降，也说明小鼠CRISP1抗体特异性地作用于精卵融合阶段，导致生育力的下降[17]。然而，与其他研究中的发现一样，CRISP1缺陷并不能导致男性完全不育[33]，mCRISP1 DNA疫苗仅能使免疫小鼠生育力下降40%～50%[31]。为了增强疫苗效果，在后续研究中，我们使用了壳聚糖-DNA纳米颗粒作为载体，显著提高了mCRISP1 DNA避孕疫苗的免疫效应[34-35]，虽然小鼠的生育力仍然没有被完全阻断，但为进一步开发出高效、安全、经济的避孕疫苗奠定了基础。

四、结语

综上，在动物研究中已经确定CRISP1参与了受精过程中的多个环节，但其中的机制仍有待进一步探索。近年的研究显示了CRISP1也对精子的运动及方向有调节作用，并提出雌性配子中也存在CRISP1。不仅不同物种之间CRISP1的表达及定位有差异，人体中CRISP1是否是仅由附睾特异性表达也无定论。因此，我们还需要对CRISP1的表达定位方面进行全面的研究。此外，目前对人CRISP1功能的研究尚少且有争议，增加对人CRISP1功能方面的研究是有意义的。以CRISP1为靶点的避孕疫苗安全且可逆，是我们以后研究的重点。因此，CRISP1对生育力的影响及作用机制值得我们进一步深入研究。