二氢杨梅素对顺铂体外抗乳腺癌作用的干预及其机制研究

胡蓉蓉 徐广涛

乳腺癌是女性发病率最高的恶性肿瘤，而且乳腺癌具有早期转移的特点。顺铂是一种广谱抗肿瘤药物，在乳腺癌的化疗中具有重要的作用，它能与肿瘤细胞DNA 发生结合从而抑制DNA的合成、复制和转录并诱导肿瘤细胞发生凋亡[1-2]。然而顺铂长期使用副反应较大。研究[3]表明，肿瘤细胞沉默信息调节因子2相关酶1（SIRT1）的表达水平与其对顺铂治疗的敏感性有关，SIRT1的过表达能提高肿瘤细胞对顺铂的抵抗性。然而，天然药物辅助治疗是否能以SIRT1为靶点促进顺铂的抗肿瘤活性，至今仍很少报道。本文探讨二氢杨梅素是否对顺铂有协同抗乳腺癌效应并研究其机制。

1 材料与方法

1.1 材 料 RPMI-1640培养基购于美国Gibco（批号 11875093）。碘化丙啶（PI，批号 P4170）、Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒（批号APOAF）、噻唑蓝（MTT，批号M2128）、二氢乙啶（DHE，批号D7008）、二氢杨梅素（批号 SML0295）、N-乙酰半胱氨酸（NAC，批号 1009005）和顺铂（批号 1134357）购于美国Sigma-Aldrich。SIRT1抗体（批号8469）、活化型Caspase-9抗体（批号20750）、活化型Caspase-3抗体（批号9661）、磷酸化JNK抗体（批号 9251）和GAPDH抗体（批号5174）购于美国Cell Signaling。增强型化学发光底物（ECL）试剂盒（货号32106）购于美国 Pierce。脂质体 2000（Lipofectamine 2000，批号11668019）购于美国Invitrogen。

1.2 细胞培养 人正常乳腺上皮细胞系MCF-10A，人乳腺癌细胞系MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-435购于美国模式培养物保藏所（ATCC）。细胞培养在含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中，培养环境为37°C恒温培养箱中培养并通入5%CO2。

1.3 质粒构建和转染 将SIRT1基因的开放阅读框架序列经PCR扩增后以分子克隆的方法与pcDNA3.1连接后构建成SIRT1重组真核表达质粒。SIRT1表达质粒用Lipofectamine 2000按试剂操作说明书步骤进行转染，将2μg/mL SIRT1表达质粒转染入MDA-MB-435细胞中。

1.4 细胞活力检测 将MDA-MB-435细胞按5×103/孔接种在96孔板上，分为对照组、二氢杨梅素组、顺铂组、顺铂+二氢杨梅素组、顺铂+二氢杨梅素+NAC组和顺铂+二氢杨梅素+SIRT1质粒组。对照组为MDA-MB-435细胞不加药物培养48h，顺铂组为在MDA-MB-435细胞中加入2μmol/L的顺铂培养48h，二氢杨梅素组为在MDA-MB-435细胞中加入10μmol/L的二氢杨梅素培养48h，顺铂+二氢杨梅素组为在MDA-MB-435细胞中加入2μmol/L的顺铂和10μmol/L的二氢杨梅素培养48h，顺铂+二氢杨梅素+NAC组为在MDA-MB-435细胞中加入2μmol/L的顺铂、10μmol/L的二氢杨梅素和2mmol/L NAC培养48h，顺铂+二氢杨梅素+SIRT1质粒组为先将2μg/mL的SIRT1表达质粒转染入MDA-MB-435细胞中培养24h，之后更换培养基再加入2μmol/L的顺铂和10μmol/L的二氢杨梅素继续培养48h。药物处理完毕后在MDA-MB-435培养体系中加入20μL 5g/L MTT再培养4h，弃去上清，往孔中加入150μL二甲亚砜，充分震荡后在570nm波长下用酶标仪检测OD值，MDA-MB-435细胞活力抑制率用以下公式计算：抑制率=（OD对照组-OD药物处理组）/OD对照组×100%。

1.5 细胞凋亡实验 将MDA-MB-435细胞按2×106/孔接种在6孔板上，按上述进行分组处理。处理完毕后按照凋亡试剂盒说明书步骤将PI和Annexin-V加入细胞中暗室孵育20min，采用流式细胞术检测MDA-MB-435细胞的凋亡，凋亡率用Annexin-V阳性细胞数占总细胞数的百分比表示。

1.6 活性氧簇（ROS）测定 将细胞按2×106/孔接种在6孔板上，按上述进行分组处理。药物处理完毕后在MDA-MB-435细胞中加入5μmol/L DHE暗室孵育20min，采用流式细胞术检测MDA-MB-435细胞ROS的水平。红色荧光越强则ROS水平越高[4]。

1.7 Western blot实验 将细胞按2×106/孔接种在6孔板上，按上述进行分组处理。药物处理完毕后将细胞用蛋白提取液提取总蛋白质。之后将提取的总蛋白质用12%SDS-PAGE进行电泳分离。分离完毕后通过电转方法将蛋白质从分离胶上转到PVDF膜上，用SIRT1抗体、活化型Caspase-9抗体、活化型Caspase-3抗体、磷酸化JNK抗体或GAPDH抗体孵育过夜，之后再用带辣根过氧化物酶的二抗孵育2h，蛋白条带用ECL试剂盒显色发光。

2 结果

2.1 二氢杨梅素增强顺铂对MDA-MB-435细胞杀伤活性 MTT实验结果显示，顺铂+二氢杨梅素组MDA-MB-435细胞的细胞活力抑制率显著高于顺铂组、二氢杨梅素组和和二氢杨梅素+顺铂+SIRT1质粒组（P均＜0.05），流式细胞实验结果显示，顺铂+二氢杨梅素组MDA-MB-435细胞的凋亡诱导率显著高于顺铂组和二氢杨梅素组（P＜0.05）。顺铂+二氢杨梅素+SIRT1组MDA-MB-435的细胞活力抑制率和凋亡诱导率显著低于顺铂联合二氢杨梅素组（P＜0.05）。见表 1。

表1 各组细胞活力抑制率、凋亡诱导率比较（%，±s）

表1 各组细胞活力抑制率、凋亡诱导率比较（%，±s）

注：与顺铂组比较，△P＜0.05；与二氢杨梅素组比较，▲P＜0.05；与顺铂+二氢杨梅素组比较，*P＜0.05

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2.2 二氢杨梅素通过抑制SIRT1表达水平增强顺铂对MDA-MB-435细胞杀伤活性 Western blot结果显示，与人正常乳腺癌上皮细胞MCF-10A比较，SIRT1在乳腺癌细胞系均发生过表达。二氢杨梅素处理后MDA-MB-435细胞SIRT1表达水平显著下调，而顺铂对SIRT1的表达无影响。为了判断二氢杨梅素发挥协同作用的机制是否与SIRT1下调有关，在MDA-MB-435细胞转染SIRT1表达质粒使SIRT1蛋白强制表达。实验结果显示，转染SIRT1质粒能显著减弱二氢杨梅素联合顺铂对MDA-MB-435细胞活力的抑制和凋亡的诱导，表明二氢杨梅素可能通过抑制SIRT1表达水平增强顺铂对MDA-MB-435细胞的杀伤活性。见图1（封二）。

2.3 二氢杨梅素通过SIRT1/ROS/JNK途径增强顺铂对MDA-MB-231细胞杀伤活性 流式细胞结果显示，二氢杨梅素能显著增强顺铂对MDA-MB-435细胞活性氧簇（ROS）的诱导产生，但转染SIRT1质粒后，二氢杨梅素不能促进ROS的产生。Western blot结果显示，二氢杨梅素联合顺铂显著诱导MDAMB-435细胞JNK蛋白的磷酸化，但用ROS清除剂NAC[5]处理后，二氢杨梅素不能增强顺铂依赖的MDA-MB-435细胞的凋亡和JNK蛋白的磷酸化。同时，二氢杨梅素联合顺铂能显著诱导MDA-MB-435细胞Caspase-9和Caspase-3活化，而转染SIRT1质粒或采用NAC处理均能抑制这些Caspases的活化，表明二氢杨梅素可能通过SIRT1/ROS/JNK途径增强顺铂对乳腺癌细胞凋亡的诱导。见图2～3（封二）。

3 讨论

二氢杨梅素提取自葡萄科蛇葡萄属的木质藤本植物，是一种天然黄酮类有效成分，具有抗氧化、抗血栓和抗炎作用。近期的研究发现二氢杨梅素还具有一定的抗肿瘤活性，能抑制肿瘤细胞的增殖和转移[4-6]，然而其对化疗药物的协同抗乳腺癌活性至今仍很少报道。

SIRT1属于组蛋白去乙酰化酶蛋白家族成员。研究表明，SIRT1的表达水平与肿瘤细胞对化疗的敏感性有关，肿瘤组织SIRT1表达越高则化疗的疗效和患者的预后越差，因此SIRT1基因已成为肿瘤治疗的一个重要靶点[7-9]。在SIRT1信号通路中，ROS发挥了重要作用。SIRT1能清除细胞中的ROS[10-11]，因此肿瘤细胞SIRT1高度表达能抑制化疗药物对ROS的诱导生成。有文献表明，ROS能介导JNK的磷酸化，而活化的JNK能增加促凋亡蛋白的表达并抑制Bcl-2抗凋亡蛋白的功能从而诱导凋亡的发生[12-13]。这些研究提示肿瘤细胞中SIRT1的抑制能增加化疗药物诱导的ROS在肿瘤细胞中积累，而大量的ROS又通过诱导JNK的活化从而诱导肿瘤细胞发生凋亡。此外，已有学者发现SIRT1/ROS通路介导顺铂对口腔鳞癌的杀伤活性[14]，然而SIRT1/ROS及其下游JNK通路是否影响顺铂对乳腺癌的抗肿瘤活性，至今仍少有报道。在本研究发现二氢杨梅素在乳腺癌细胞中的直接靶点是SIRT1蛋白，二氢杨梅素辅助治疗能显著降低肿瘤细胞SIRT1表达水平，当在细胞中转染SIRT1质粒强制增加它的表达水平后，二氢杨梅素对顺铂的协同抗乳腺癌活性受到明显抑制。另外，还发现SIRT1过表达能明显抑制二氢杨梅素联合顺铂对乳腺癌细胞ROS的产生，同时NAC（ROS清除剂）处理能抑制JNK的活化，表明二氢杨梅素发挥对顺铂协同效应的机制可能与SIRT1/ROS/JNK途径的变化有关。

综上所述，本研究结果显示，二氢杨梅素对顺铂有协同抗乳腺癌效应。其机制可能是二氢杨梅素通过下调SIRT1表达促进顺铂对乳腺癌细胞Caspase依赖的凋亡。

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