巴豆醛抑制小鼠心肌收缩功能

刘衍冬，金 伟，邓琴琴，裴兆辉

(南昌市第三医院 心血管内科， 江西 南昌 330006)

吸烟严重危害人类健康，香烟烟雾会导致遗传毒性和致突变效应[1- 2]，但香烟烟雾成分对心肌结构和功能影响的机制研究很少。最近报道，一种主要存在于香烟烟雾中的污染物α，β-不饱和醛能损伤心肌细胞[3]，其机制仍不太清楚。本文研究巴豆醛，一种存在于香烟烟雾中的主要α，β-不饱和醛和脂质过氧化终产物，对小鼠心肌细胞收缩功能的影响及其机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物：6～8周龄雄性SPF级C57BL/6小鼠，体质量18～25 g[湖南省斯莱克景达有限公司，许可证号：SYXK(赣)2010- 0002]。

1.1.2 主要试剂：巴豆醛(西亚试剂公司)；Na+-Ca2+交换体抗体和GAPDH抗体(Santa Cruz公司)；BCA蛋白测定试剂盒(APPLYGEN公司)；超敏ECL化学发光试剂(Thermo Scientific公司)；fura- 2/AM(Invitrogen公司)；其他分析纯购买于天津大茂化学试剂厂。

1.2 方法

1.2.1 小鼠心肌细胞的分离和药物处理：常规麻醉小鼠后，取出心脏悬挂于Langendorff装置上用KHB缓冲液灌注(mmol/L)：118 NaCl，4.7 KCl，1.2 MgSO4，1.2 KH2PO4，25 NaHCO3，10 HEPES，11.1 Glucose。具体步骤参照文献[4]。分离出的小鼠心肌细胞与不同浓度(1、10、25和50 μmol/L)巴豆醛孵育6 h，对照组不经巴豆醛处理，所有实验在环境温度25 ℃下进行。

1.2.2 心肌细胞收缩/舒张功能的测定：用SoftEdge MyoCam系统检测心肌细胞的机械功能，具体步骤参照文献[4]，分别检测心肌细胞收缩峰值(peak shortening，PS)、收缩峰值时间(time-to-PS，TPS)、舒张90%时间(time-to-90% relengthning，TR90)以及最大收缩/舒张速率(maximal velocity of shortening/relengthening，±dL/dt)。

1.2.3 心肌细胞内Ca2+功能的测定：将fura- 2/AM(0.5 μmol/L)与小鼠心肌细胞在室温下避光孵育10 min，用双激发荧光光电倍增系统检测荧光信号，具体步骤参照文献[5]。细胞内的游离Ca2+荧光指示剂被激发，其在480 nm和520 nm处波长荧光下记录fura- 2荧光强度(fura- 2 fluorescence intensity，FFI)、ΔFFI，荧光延迟时间用细胞内Ca2+的清除率来衡量。

1.2.4 SERCA45Ca2+摄取的测定：小鼠心肌细胞经不同浓度(1、10、25和50 μmol/L)巴豆醛处理6 h后，制作心肌细胞匀浆并溶解在匀浆缓冲液中：30 mmol/L Tris-HCl，8%蔗糖，1 mmol/L PMSF和2 mmol/L二硫苏糖醇。心肌细胞与SERCA抑制剂毒胡萝卜素(10 μmol/L)一起孵育15 min，加与未加毒胡萝卜素滤膜放射性之差为毒胡萝卜素依赖的SERCA45Ca2+摄取量。具体步骤参照文献[6]。

1.2.5 Western blot检测Na+-Ca2+交换体蛋白：心肌细胞经细胞裂解液裂解后提取总蛋白，按BCA法检测蛋白浓度。取等量蛋白样品，SDS-PAGE胶电泳后将分离的蛋白质转移至PVDF膜上，用5%脱脂奶粉封闭后，加入按相应比例稀释Na+-Ca2+交换体抗体及内参GAPDH抗体，4 ℃孵育过夜。经TBST洗膜除去过量的一抗，然后加入二抗，室温孵育2 h，TBST洗膜。最后ECL发光显影，采用Image LabTM软件分析曝光条带吸光度值。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 不同浓度巴豆醛对小鼠心肌细胞收缩功能的影响

巴豆醛对小鼠心肌细胞的整体形态无明显影响(图1)。与对照组相比，25和50 μmol/L的巴豆醛能明显降低小鼠心肌细胞PS和±dL/dt(P<0.05)，并能延长TR90(P<0.05)(图2)。

2.2 不同浓度巴豆醛对小鼠心肌细胞内Ca2+功能的影响

与对照组相比，25和50 μmol/L的巴豆醛能明显减少小鼠心肌细胞内ΔFFI和延缓心肌细胞内Ca2+衰减(P<0.05)，但不影响静息和峰值心肌细胞内FFI(图3)。

2.3 不同浓度巴豆醛对小鼠心肌细胞内SERCA 45Ca2+摄取及Na+-Ca2+交换体的影响

与对照组相比，较高浓度巴豆醛(25和50 μmol/L)能抑制小鼠心肌细胞SERCA活性(P<0.05)，而低浓度巴豆醛(1和10 μmol/L)对SERCA活性无抑制作用(图4A)；巴豆醛对小鼠心肌细胞Na+-Ca2+交换体的表达无明显影响(图4B)。

3 讨论

香烟烟雾中的α，β-不饱和醛被认为是慢性吸烟诱发的组织器官损伤的主要因素之一[7- 8]。巴豆醛是一种重要的α，β-不饱和醛，它能与呼吸道黏液系统或细胞大分子物质发生反应[9]。

本研究采用单个小鼠心肌细胞进行实验，其优点是能准确地控制心肌细胞所处的外环境，避免来自周围成纤维细胞、内皮细胞代谢和扩散屏障的干扰[5]。小鼠心肌细胞与不同浓度巴豆醛孵育6 h后，并不影响小鼠心肌细胞的整体形态，但它能明显降低心肌细胞PS、±dL/dt和细胞内Ca2+释放，并延长心肌细胞TR90和延缓细胞内Ca2+衰减，导致小鼠心肌细胞收缩/舒张功能损害和细胞内Ca2+功能异常。

图1 不同浓度巴豆醛对小鼠心肌细胞形态的影响Fig 1 Effect of crotonaldehyde with different concentrations on cardiomyocytes morphology in mouse(×200)

A.resting cell length; B.peak shortening (% of resting cell length); C.maximal velocity of shortening (+dL/dt); D.maximal velocity of relengthening (-dL/dt); E.time-to-peak shortening (TPS); F.time-to-90% relengthening (TR90);*P<0.05 compared with control group

图2不同浓度巴豆醛对小鼠心肌细胞收缩/舒张功能的影响

A.resting fura- 2 fluorescence intensity (FFI); B.peak FFI; C.increase of FFI (ΔFFI) in response to electrical stimuli; D.intracellular Ca2+decay;*P<0.05 compared with control group

图3不同浓度巴豆醛对小鼠心肌细胞Ca2+功能的影响

A.SERCA activity measured by45Ca2+uptake; B.Na+-Ca2+exchanger expression; Inset: representative gel bots depicting expression of Na+-Ca2+exchanger and GAPDH;*P<0.05 compared with control group

图4不同浓度巴豆醛对小鼠心肌细胞Na+-Ca2+交换体表达及SERCA45Ca2+摄取的影响

长期给小鼠喂食丙烯醛(一种α，β-不饱和醛)诱导小鼠扩张型心肌病后，小鼠左心室明显扩张，并且其左室收缩功能及舒张功能明显受损[3]，这与本结果相一致。进一步实验证实，巴豆醛能抑制心肌细胞SERCA功能而不影响Na+-Ca2+交换体的表达，从而影响心肌细胞内Ca2+稳态。心肌细胞经巴豆醛处理后其收缩能力减弱是由于巴豆醛影响了心肌细胞内Ca2+稳态，香烟烟雾可通过引起心肌细胞内Ca2+紊乱导致小鼠心脏收缩功能障碍[4]，提示心肌细胞内Ca2+紊乱是巴豆醛诱导小鼠心肌收缩功能障碍的重要机制。SERCA和Na+-Ca2+交换体在心肌舒张期时将细胞质中的Ca2+转入到细胞外发挥重要作用[10- 11]。本实验观察到巴豆醛能明显降低SERCA活性，导致肌浆网(SR)对Ca2+摄取降低，从而细胞内Ca2+增加，引起心肌舒张功能障碍(延长心肌细胞TR90和延缓细胞内Ca2+衰退)。已证实氧自由基通过抑制L型Ca2+电流、Na+-Ca2+交换和SR Ca2+摄取而破坏心肌细胞内Ca2+稳态[12- 14]，进而影响心肌细胞收缩功能。因此，巴豆醛可能还通过氧化应激来诱导心肌细胞心脏收缩功能障碍。下一步笔者将针对巴豆醛诱导的氧化应激揭示巴豆醛诱导心肌细胞损伤的另一机制。

综上所述，巴豆醛可抑制小鼠心肌细胞内SERCA活性，导致心肌细胞内Ca2+功能异常，从而抑制心肌细胞的收缩功能。

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