FOXM1在人类结肠癌中的表达及意义＊

曹原，尧阳扬，郭惠，刘镇，熊建萍

(南昌大学第一附属医院肿瘤科，南昌 330006)

结肠癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，其发病率呈逐年上升的趋势，严重威胁我国居民健康。在我国，随着人群生活方式的日益西化以及过多高脂高热食物的摄入、肥胖、吸烟以及缺乏锻炼等因素，结直肠癌的发生率正在日益攀升，纵使目前手术技术及新辅助化疗在结直肠癌早期诊断及治疗上取得了一定的进步，但对结直肠癌伴远处转移的病人，其5年生存率仍在12.5%以下。结肠癌患者绝大多数初诊时已为晚期，其病情进展快、预后差[1]。结肠癌的早期诊断技术落后是导致结肠癌死亡率及复发率高的主要原因，由于其确切的分子机制仍不甚清楚，目前缺乏有效的预防和治疗措施。最近多项研究表明基因突变与结直肠癌的预后及治疗密切相关，鉴于此，很多的分子靶向治疗药物应运而生[2-5]。因此，探讨发现结肠癌的新型肿瘤标志物和治疗靶点，对于结肠癌的早期诊断、预后判断和指导治疗意义重大。

Forkhead Box转录因子家族成员转录因子叉头盒蛋白 M1（Forkhead box M1，FOXM1）是叉头盒蛋白家族重要的成员，是一种增殖相关的致瘤性的转录因子，具有在进化上保守的螺旋翼状(Winged Helix)DNA结合域。FOXM1的表达仅局限于成人组织分裂活跃的细胞中，例如胸腺、睾丸、结肠和小肠，然而在静止期或分化的细胞中几乎不表达[6，7]。目前研究已证实FOXM1的表达对多种肿瘤细胞的发生发展起到至关重要的作用。大量基因芯片分析结果显示FOXM1在超过20种实体肿瘤中高表达，如肝细胞癌、胰腺腺癌、乳癌、卵巢癌、肺癌以及结直肠癌等[8-14]。FOXM1在细胞增殖、凋亡、细胞周期进展、血管生成、EMT、DNA损伤修复和代谢等许多生理过程中发挥重要作用。现已证实FOXM1可通过激活尿激酶型纤溶酶原激活剂受体（PLAUR，urokinase-typeplasminogenactivator receptor）促进结肠癌细胞侵袭及转移[14]。最近，一些研究已经表明，FOXM1可增强DNA损伤修复基因，如乳腺癌相关基因（BRCA2），X线交叉互补基因 1（XRCC1）和 RAD5 的表达[16，17]，而敲除 FOXM1显示降低了结肠癌细胞DNA复制[18]。

在本项研究中，我们用生物信息学网站GEPIA证实了绝大多数肿瘤中FOXM1的基因表达量都有不同程度的增加，同时查询生物信息学网站cBioPortal发现结肠癌中FOXM1的基因变异率较高，同时我们运用westren boltting技术比较结肠癌组织及其相对应的临近非癌组织中FOXM1蛋白的表达水平，发现在结肠癌组织中FOXM1的表达比邻近非癌组织中的表达水平更高。这些结果表明，FOXM1在人类结肠癌中的表达量有所增加，并可能成为结肠癌患者的新型预后因子。

1　材料和方法

1.1临床标本该研究方案经南昌大学第一附属医院批准。在知情同意的情况下收集结肠癌患者的新鲜肠癌手术标本及对应的非癌组织共4对。

1.2蛋白质印迹从新鲜组织中提取总蛋白，并用冰冷的裂解缓冲液裂解。用10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质，然后转移到聚偏二氟乙烯膜上。用5%脱脂牛奶封闭膜，然后用针对FOXM1（Abgent，USA）和 β-肌动蛋白（Affinity，USA）的一级抗体进行免疫印迹，其次是辣根过氧化物酶（HRP）偶联的二抗（ZSGB，中国）。使用化学发光溶剂（Thermo，USA）检测信号。

2　结果

2.1各肿瘤样本及其配对正常组织的FOXM1的mRNA表达情况本研究中，我们使用生物信息学网站 GEPIA（http：//gepia.cancer-pku.cn）对 FOXM1在人类各恶性肿瘤样本及其配对正常组织样本中的mRNA表达情况进行分析。结果表明，在绝大多数样品中FOXM1在肿瘤组织中的mRNA表达中值均大于其配对的正常组织样品 （图1A和1B）。其中在结肠癌样品中的FOXM1的mRNA表达中值为30.78PTM，而在相应正常组织中的表达中值为2.47PTM。

图1　图1A GEPIA（http：//gepia.cancer-pku.cn）中跨所有肿瘤样品和配对的正常组织的FOXM1 mRNA表达谱。注：纵坐标代表肿瘤类型或正常组织中FOXM1的mRNA表达中值。图1B GEPIA（http：//gepia.cancer-pku.cn）中跨所有肿瘤样品和配对的正常组织的FOXM1 mRNA表达散点图

2.2FOXM1在结直肠癌中DNA的改变情况为了进一步探讨FOXM1基因在结肠癌中表达情况，对FOXM1在结直肠腺癌中的改变频率及情况进行信息挖掘。一项研究统计了249例结肠腺癌患者FOXM1基因改变的情况，这些病例中有高达2.81%的病例出现FOXM1基因的改变，其中2.01%为突变，0.4%为扩增，0.4%为多重改变；还有一项统计数据针对122例直肠腺癌患者，这些病例中有高达2.46%的病例出现FOXM1基因的改变，其中1.64%为突变，0.82%为扩增；更有说服了的是，来自cBioPortal数据库的一项更大样本量的统计同时纳入了结肠腺癌和直肠腺癌患者，发现在2001例结直肠癌病例中有0.8%的病例出现FOXM1基因的改变，其中0.75%为突变，0.05%为扩增（见图2A）。说明FOXM1在结直肠癌，尤其是结肠癌中的存在高频率的DNA突变现象。

2.3结肠癌组织中FOXM1蛋白的表达较临近非癌组织高在查询和挖掘上诉生物信息学依据之后，我们通过westren blotting技术对4对结肠癌及其邻近非癌组织进行FOXM1蛋白质表达分析，以验证结肠癌中FOXM1在蛋白水平的表达。结果显示：4对组织中，结肠癌组织中FOXM1蛋白的表达比邻近非癌组织中的表达水平更高（图3A）。

图2　图2A cBioPortal(http：//www.cbioportal.org)中3项数据显示FOXM1在结直肠癌中的DNA的改变情况。

图3　图3A 6对结肠癌及其邻近非癌组织的FOXM1表达水平

3　讨论

Forkhead Box转录因子家族成员FOXM1是一种进化上保守的致癌性转录因子。FOXM1在细胞增殖、凋亡、细胞周期进展、血管生成、EMT、DNA损伤修复和代谢等许多生理过程中发挥重要作用。有研究表明，FOXM1表达与晚期非小细胞肺癌患者的预后不良相关，并且与非小细胞肺癌的上皮间质转化有关[19，20，21]。 在白血病细胞中，miR-370的异位表达通过靶向抑制FOXM1表达，诱导细胞生长停滞和衰老[22]。现已证实FOXM1可通过激活尿激酶型纤溶酶原激活剂受体（PLAUR，urokinasetype plasminogen activator receptor）促进结肠癌细胞侵袭及转移[15]。FOXM1还可增强DNA损伤修复基因，如乳腺癌相关基因（BRCA2），X线交叉互补基因 1 （XRCC1） 和 RAD51的表达[16，17]。 此外，Yoshida等[18]发现FOXM1基因敲除小鼠结肠癌细胞DNA复制及生长能力显著减弱。一项研究表明，FOXM1靶向Nijmegen破坏综合征1（NBS1）来调节DNA损伤诱导的乳腺癌细胞衰老[22]。miRNA在结肠癌中的研究也越来越多[23]，既往的文献表明多种miRNA可以靶向FOXM1参与调控结肠癌细胞的耐药[22，24]。

在本项研究中，我们通过在生物信息学网站，挖掘了人类各肿瘤样本中FOXM1的表达情况，发现在绝大多数人类肿瘤样本中FOXM1的表达中值均大于正常组织，这表明，FOXM1的异常表达在肿瘤的发生和发展中起着关键作用。FOXM1在结直肠癌中基因突变和扩增比较频繁，基因水平的异常改变是FOXM1表达异常的重要原因之一。通过大数据我们证实了FOXM1在结肠癌中的DNA改变频率较高，mRNA的表达较正常组织高，并且我们结合实验证实肿瘤中FOXM1在蛋白水平上表达较正常组织亦增高。因此我们认为FOXM1作为结肠癌患者新的治疗靶点及预后生物指标是有意义的。

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