200例人乳头瘤病毒基因分型检测及感染情况分析

叶健翔，温宝欣，何嘉颖

(广东省肇庆市第二人民医院，肇庆 526060)

人类乳头瘤病毒（HPV）属于乳多空病毒科的乳头瘤空泡病毒A属，确切来说，是一种球形DNA病毒，HPV可引起人体皮肤粘膜的鳞状上皮增殖。感染HPV后可表现为寻常疣和生殖器疣等症状。研究指出，HPV可引起生殖道感染，从而诱发尖锐湿疣、宫颈病变、宫颈癌，因此，HPV检测已经成为宫颈癌筛查的主要方法[1，2]。宫颈癌属妇科常见恶性肿瘤，且发病率有逐年增高趋势，发病年龄越来越趋于年轻化，近年来，随着宫颈细胞学筛查的应用，宫颈癌的早期病变检出率已经越来越高。由于HPV的基因分型较多，且不同地区的感染率和基因分型均在明显差异，通过分析当地区域女性HPV的感染和基因分型情况，对于当地筛查和防治宫颈癌具有重要指导意义[3-5]。本研究就本地区200例HPV感染情况和基因分型情况进行研究分析，现将结果报告如下：

1　资料与方法

1.1临床资料选取2017年1月-6月期间在广东省肇庆市第二人民医院接受HPV基因分型检测的200例女性进行观察分析，年龄18-67岁，平均年龄（42.5±8.0）岁。纳入标准：入选女性均有性生活史；搜集标本前要求月经过后，2d内无性生活史，且白带清洁度检查正常。排除标准：细菌性、霉菌性、滴虫性阴道炎。

1.2方法标本采集：受检者保持膀胱截石位，标本采集人员使用扩阴器显露宫颈口，并用棉拭子将宫颈口的分泌物擦去，将宫颈刷置入宫颈口处，紧贴于宫颈口顺时针转动，转动圈数为4-5圈，然后抽出宫颈刷，将刷子放入有细胞保存液的试管中，在管口处沿折痕将宫颈刷折断，将刷头保留在试管中，做好标识，将标本保存于-20℃的冰箱中，1周内完成检测。

检测仪器和试剂：使用上海宏石SLAN-96P型基因扩增仪。所用试剂由硕世生物技术有限公司提供，所检的HPV病毒亚型共有21型，其中包括18中高危亚型和3种低危亚型，高危亚型包括16、18、26、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73、82，低危亚型包括 6、11、81 亚型。

检测方法：⑴HPV DNA的提取：①取出标本，振荡混匀，吸取500μl样本于带螺口的离心管中，12000rpm离心1min，小心吸取上清，保留沉淀物。②加入400μl溶液A，振荡混匀，100℃水浴或干浴煮10min。③加入400ul溶液B，振荡混匀，室温放置2min，12000rpm离心5min，弃上清液，室温放置2min。④加入60μl溶液C，充分溶解，室温静置5min，12000rpm离心1min，上清液即为核酸溶液。⑵PCR扩增：小心打开PCR八联管盖，每份待测样本核酸溶液、空白对照、阳性对照按照2μl/管依次加入对应编号含有A-H反应体系的PCR八联管中，1排PCR八联管为1人份。将加好样的八联管放上实时荧光定量PCR仪上时行扩增。

1.3判定标准在仪器正常，空白对照、阳性对照、H组的FAM通道均正常的情况下，根据HPV亚型探针荧光标识表进行分析。根据参考值，在A-H组中的HPV亚型扩增曲线呈典型S型曲线且CT值小于参考值，判断相应的HPV亚型为阳性。

1.4统计学方法采用SPSS 19.0的统计学软件进行统计学数据，计数资料以（n，%）表示，经 χ2检验，P＜0.05时为组间差异有统计学意义。

2　结果

2.1HPV感染情况及基因分型检出情况200例受检女性中，共检出63例HPV感染，感染率为31.50%；63例HPV阳性标本中，检出16种亚型，其中包括高危亚型12型，低危亚型4例。高危亚型中以HPV16最常见，低危亚型中以HPV54型最常见。

2.2HPV单一亚型和多重亚型感染情况200例受检女性中，检出63例HPV感染，单一亚型感染的检出率明显高于多重亚型感染，差异有统计学意义（P＜0.05），见表 1。

表1　HPV单一亚型和多重亚型感染情况（%）

2.3不同年龄组HPV感染情况比较 将入选女性按照年龄分组，即年龄≤25岁、26-35岁、36-45岁、46-55岁、56-65岁以及年龄＞65岁，各年龄阶段的HPV感染率比较，差异存在统计学意义（P＜0.05），且随着年龄增长，其感染率有逐渐下降趋势，见表2。

表2　不同年龄组HPV感染情况比较

3　讨论

人乳头瘤病毒（HPV）与宫颈癌的相关性研究已经明确HPV感染是导致宫颈癌的直接原因，也是诱发宫颈癌的必要条件[6]。针对HPV感染的女性，其宫颈癌的发病风险较无HPV感染的女性发病风险更高。宫颈癌属妇科常见疾病之一，严重影响女性的生命健康。由于宫颈癌的发生发展是宫颈上皮内瘤变到浸润癌的一个过程，其可预防，因此，尽早发现宫颈上皮内瘤变和宫颈癌，对于该疾病的诊断和治疗尤为重要。HPV属乳多空病毒科的乳头瘤空泡病毒A属，是一种球形DNA病毒，可引起皮肤粘膜鳞状上皮增殖。目前，临床已经分离出130多种HPV亚型，不同型别引起的临床表现也不同。目前，我国皮肤型HPV人群的感染率较普遍，如趾疣、扁平疣、寻常疣等，另外，高危型HPV和外生殖器低危型HPV感染，可造成生殖器疣和宫颈炎。相关流行病学研究表明，在全球性病当中，HPV感染引起的生殖器疣占15%-20%[7]。虽然目前我国并无大量关于HPV流行病学筛查的样本报告，但因HPV感染造成的尖锐湿疣发病率呈逐年升高的趋势，也是性病中发病率最高的疾病。而我国每年大约有13.15万新发的宫颈癌病例，且发病率和死亡率还在逐渐增长，且发病年龄越来越趋于年轻化。由此可见，分析HPV感染情况及基因分型检测，对于防治宫颈癌具有重要指导意义。

PCR分子生物学检测技术是近几年用于HPV感染诊断的一项新技术，对于HPV DNA检测的敏感性较高，尤其是在亚临床感染和潜伏感染诊断中，PCR体现出了较传统检测方法更好的优势[8]。目前，PCR检测PCR DNA的方法包括斑点迹象、荧光定量PCR、Southern印记等，其中荧光定量PCR的效果最理想，其准确性和灵敏度均已受到临床认可[9]。

1990年，WHO证实将高危型HPV确定为宫颈癌的治病因子，因此对于HPV基因分型的检测尤为重要，有利于宫颈癌的筛查。本研究通过分析在我院进行HPV检测的女性临床资料，入选的200例女性中，HPV感染率为31.50%。在赤峰地区HPV的感染率为30.34%，武汉地区HPV感染率为14.9%，大连地区HPV感染率为17.09%，本地区HPV感染率均高于其它地区，说明HPV的感染有明显的低于特征，可能与当地的经济水平、生活方式、初婚年龄、婚外性行为等原因有关。曾选[10]等研究也提示，对117799例女性宫颈分泌物进行HPV分型检测，其中HPV阳性率为20.94%，单一感染率占74.71%，多重感染占25.29%，且各个年龄阶段中HPV阳性检出率存在明显差异。

本研究结果提示，年龄＞65岁HPV的感染率最低，而在26-55岁之间，发病率相对较高，且随着女性年龄增长，HPV的感染率呈逐渐下降趋势，王长奇[11]等对1336例HPV感染女性的感染率、感染亚型分布特点、HPV感染相关因素进行分析，结果提示，36-40岁HPV阳性检出率位6.1%，而41-45岁检出率为5.1%，46-50岁检出率为3.4%。说明临床应当重视宫颈癌发病年龄越来越趋于年轻化的问题。原因是，现代女性初次性行为年龄提前，加上性生活频繁，宫颈鳞柱状上皮尚处于转化期，给HPV吸附在细胞表面提供了机会，从而使得该年龄阶段的女性更易受到HPV的感染[12]。研究结果还提示，单一亚型感染的检出率明显高于多重亚型感染。

造成宫颈癌的病因是HPV感染宫颈上皮，并使其发生瘤变，目前我国宫颈癌的三级预防中，消除HPV感染是最重要的措施，其中包括注射HPV疫苗和采用利普刀治疗HPV感染。宫颈癌疫苗的注射比较简单，且效果理想。注射HPV预防性疫苗的机制是通过体液免疫预防HPV感染，靶抗原以HPV的衣壳蛋白L1和L2为主，通过诱导机体产生较高滴度的中和抗体，从而诱发局部的免疫反应，从而防止HPV长期/重复感染[13]。

综上所述，本地区的HPV感染以单项基因感染为主。通过对当地女性进行HPV基因分型检测，对当地筛查、防治宫颈癌具有重要意义。只有全面开展宫颈癌的筛查，做到早发现、早诊断、早治疗，才可能控制或降低宫颈癌的发病率和死亡率。

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