古茶树优系矢车菊素分析

成　凯，刘进平，邓代信，陈正武，李忠朝，周绍均，牛素贞

(1.贵州大学 农学院， 贵州 贵阳 550025； 2.贵州大学 园艺专业学科实验室， 贵州 贵阳 550025； 3.贵州省茶叶研究所， 贵州 贵阳 550025； 4.都匀市科技和知识产权局， 贵州 都匀 558000； 5.遵义市产品质量检验检测院， 贵州 遵义 563000； 6.国家茶及茶制品质量监督检验中心(贵州)， 贵州 遵义 563000； 7.贵州大学 茶学院， 贵州 贵阳 550025)

古茶树作为初级茶树种质资源，具有遗传多样性丰富、保存和研究价值高等特点。古茶树资源中蕴含的许多特异性状，如高茶多酚、低咖啡碱、高茶氨酸、高抗性基因源、茶黄素形成能力强等可以直接利用，也可以作为突破性育种的材料[1-4]。目前，关于古茶树资源的研究主要集中在古茶树资源的调查和保护[5-9]、遗传多样性和遗传育种[10-11]方面，且存在较强的地域性[4]，而针对古茶树品质的研究较少[12-15]。花青素又名花色素，是一种广泛存在于茶叶中的天然色素，具有抗氧化、抗癌、抗炎、预防心脑血管疾病、保护肝脏等多种生理活性[16-17]。目前已知的花青素有20多种，食品中主要有6 种即天竺葵素、矢车菊素、飞燕草素、芍药色素、矮牵牛色素和锦葵色素[18]。肯尼亚曾报道，茶叶中的花青素主要是矢车菊素、天竺葵素和飞燕草素、芍药素和锦葵素[19]；Terahara等[20]从Benibana-cha品种的茶树花中提取得到3种花青素：矢车菊-3-O-β-D-半乳糖苷、飞燕草-3-O-β-D-半乳糖苷、飞燕草 3-O-B-D-(6-(E)-P-香豆酰)半乳糖苷；费旭元[19]采用高效液相色谱法在紫娟烘青绿茶中检测到的花青素种类为：天竺葵素-3，5-二葡萄糖苷、矢车菊-3-O-半乳糖苷、天竺葵素。本实验采用高效液相色谱(high performance liquid chromatography，HPLC)法，以种植在贵州大学教学实验茶园的4个古茶树优系为材料，同时以春梢一芽二叶为研究对象，分析其矢车菊素的含量，其目的在于筛选出一种适宜检测古茶树矢车菊素的液相色谱条件，为评价贵州大学教学实验茶园的4个古茶树优系花青素含量、探究茶叶花青素积累模式等提供一定的理论依据。

1　材料与方法

1.1　材料与试剂

供试材料为种植于贵州大学教学实验茶园的2号、3号、4号、6号古茶树扦插4年生茶树，同时以贵州大学教学实验茶园中的福鼎大白茶扦插4年生茶树作为对照(CK)。

主要试剂为矢车菊素标准品(标准品购买于SK Chemicals)，甲醇、三氯甲烷、乙酸乙酯、盐酸(该4种药品均为分析纯)，乙腈、甲酸、磷酸二氢钾、磷酸(4种药品均为色谱纯)等。

1.2　仪器与设备

主要仪器与设备为滤纸、漏斗、玻璃棒、铁架台、烧杯、容量瓶、微波炉、水浴锅、三角瓶、分光光度计、分析天平、电热恒温水浴锅、高效液相色谱仪(日本岛津公司的LC-20A)、色谱工作站(日本岛津公司)、色谱分析柱(日本岛津公司Shimpack VP-ODS 2.1 mm×100 mm、3.0 μm)。

1.3　方法

1.3.1样品制备

于2015年春季取春稍一芽二叶，材料在250 ℃滚筒杀青机里杀青，杀青后放入103 ℃干燥箱里干燥40 min，将烘干茶叶磨成粉末，用电子天平精确称取茶样粉末3 g，放置于100 mL容量瓶中，加入5%盐酸-甲醇溶液稀释，定容至刻度线，摇匀后，移动到超声波提取30 min，使原材料冷却，冷却后，进行过滤，样品备用。

1.3.2测试参数的确定

流动相的筛选：准确称取1 mg矢车菊素标准品溶解在1 mL酸性甲醇溶液中，取0.3 mL定容在10 mL的容量瓶中，用酸性甲醇溶液溶解并定容至10 mL。检测器检测波长520 nm、色谱柱流速1.0 mL·min-1、柱温40 ℃、进样分析时间5 min、进样量10 μL，采用不同流动相处理以确定测试参数。以进样浓度0.15、0.30、0.45、0.60 μg·μL-1为水平坐标(x)，峰面积为纵坐标(y)制作标准曲线。

表1不同流动相处理

Table1Treatment of different mobile phase

处理Treatment流动相AMobilephaseA流动相BMobilephaseB流动相A/流动相BMobilephaseA/MobilephaseB检测波长Detectionwavelength/nm流速Flowvelocity/(mL·min-1)柱温Columntemperature/℃进样量Injectionvolumn/μL处理1Treatment10.5%甲酸0.5%Formicacid乙腈Acetonitrile1∶95201.04010处理2Treatment2超纯水Ultrapurewater甲醇Methanol1∶95201.04010处理3Treatment3超纯水Ultrapurewater乙腈Acetonitrile1∶95201.04010处理4Treatment4超纯水Ultrapurewater乙腈Acetonitrile9∶15201.04010处理5Treatment5超纯水Ultrapurewater甲醇Methanol9∶15201.04010处理6Treatment6超纯水Ultrapurewater乙腈Acetonitrile3∶75201.04010

1.3.3数据分析

采用Microsoft Excel软件对数据进行常规整理，运用SPSS软件进行相关分析。

2　结果与分析

2.1　高效色谱仪流动相的选择优化

图1结果表明，在本实验的色谱条件下，矢车菊素标准品中的色谱分析各不相同，但是在处理3的色谱条件下矢车菊素的出峰强度最大，对称性最好。

2.2　矢车菊素标准曲线

以矢车菊素标准品的质量浓度为横坐标(x)，峰面积为纵坐标(y)进行线性回归分析，绘制标准曲线y=609.2x+3.086，标准曲线的相关系数达到了0.999 1，出峰时间2.35 min，线性范围0～0.6 μg·μL-1，说明矢车菊素质量浓度与峰面积的线性相关性较好。

A， 处理1；B， 处理2；C， 处理3；D， 处理4；E， 处理5；F， 处理6。A， Treatment 1; B， Treatment 2; C， Treatment 3; D， Treatment 4; E， Treatment 5; F， Treatment 6.图1　不同色谱条件对矢车菊素峰值和对称性的影响Fig.1　Effect of different chromategraphic conditions on peak value and symmetry of cyanidin

2.3　茶叶样品中矢车菊素含量

通过计算结果可知，4个古茶树优系之间存在差异显著性，其中，古茶4号的矢车菊素含量最高，古茶2号的矢车菊素含量最低，且均与对照福鼎大白茶达到差异显著性(图2)。

不同小写字母表示处理间在5%水平的差异显著性(P<0.05)。Bars with different lowercase letters showed significant difference(P<0.05).图2　茶样中矢车菊素的含量Fig.2　Cyanidin content of in tea

3　小结

本实验采取HPLC法定性定量分析贵州大学教学实验茶园的2号、3号、4号、6号古茶树优系的矢车菊素的含量，结果发现，古茶4号的矢车菊素含量最高，古茶3号矢车菊素含量次之，且均显著高于对照福鼎大白茶，而古茶2号矢车菊素含量较低，显著低于对照福鼎大白茶。除定量测定4个古茶树优系矢车菊素外，本研究在测定过程中，根据筛选出的溶剂以及色谱条件，以出峰的最大强度和对称性为依据，选择出最合适的分析参数为检测器检测波长520 nm、色谱柱流速1.0 mL·min-1、柱温40 ℃、分析时间5 min、流动相A为超纯水，流动相B为乙腈，体积比1∶9。

参考文献(References)：

[1]王平盛，虞富莲.中国野生大茶树的地理分布、多样性及其利用价值[J].茶叶科学，2002，22(2):105-108.

WANG P S， YU F L. The geographic distribution， diversity and utilization of wild tea Camellias in China[J].JournalofTeaScience，2002，22(2):105-108.(in Chinese with English abstract)

[2]许玫，王平盛，唐一春，等.中国云南古茶树群落的分布和多样性[J].西南农业学报，2006，19(1) :123-126.

XU M， WANG P S， TANG Y C， et al. Studied on the distribution and diversity about ancient tea trees ceno species in Yunan， China[J].SouthwestChinaJournalofAgriculturalSciences，2006，19(1) :123-126.(in Chinese with English abstract)

[3]唐一春，杨胜美，季鹏章，等.云南野生茶树资源的多样性、利用价值及保护研究[J]. 西南农业学报，2009，22(2) : 518-521.

TANG Y C， YANG S M， JI P Z， et al. Study on the diversity， utilization and protection of wild tea germplasm in Yunnan[J].SouthwestChinaJournalofAgriculturalSciences， 2009，22(2) : 518-521.(in Chinese with English abstract)

[4]宋勤飞，牛素贞，何嵩涛，等. 久安古茶树春梢芽叶性状及生化成分分析[J].西南农业学报，2013，26(2) :505-509.

SONG Q F， NIU S Z， HE S T， et al. Analysis on leaf bud characters and biochemical components in spring shoots of Jiuan Ancient tea tree[J].SouthwestChinaJournalofAgriculturalSciences， 2013，26(2) :505-509. (in Chinese with English abstract)

[5]沈晓进.昆明十里香古茶树保护与利用的探讨[J].西南林学院学报，2004，24(2) : 27-29.

SHEN X J. Research on protection and utilization of old ‘Shilixiang’ tea trees in Kunming[J].JournalofSouthwestForestryCollege，2004，24(2) : 27-29.(in Chinese with English abstract)

[6]陈红伟. 西双版纳古茶树资源的多样性与可持续利用[J].安徽农业科学，2011，9(14) : 8529-8530，8532.

CHEN H W. The diversity and sustainable utilization of Xishuangbanna ancient tea tree resource[J].JournalofAnhuiAgriculturalSciences，2011，9(14) : 8529-8530，8532.(in Chinese with English abstract)

[7]谭光荣，陈红伟. 勐海县古茶树资源及其保护利用[J].现代农业科技，2011(6) : 95-97.

TAN G R， CHEN H W. The protection and utilization of the ancient tea resources in Menghai[J].ModernAgriculturalTechnology， 2011(6) : 95-97.(in Chinese)

[8]刘本英，孙雪梅，宋维希，等.云南西双版纳古茶树的地理分布、多样性及其利用[J].中国农学通报，2010，26(22) : 344-349.

LIU B Y， SUN X M， SONG W X， et al. Geographic distribution， diversity and utilization of ancient tea plants from Xishuangbanna Area in Yunnan[J].ChineseAgriculturalScienceBulletin，2010，26(22) : 344-349.(in Chinese with English abstract)

[9]张俊，王平盛，陈红伟，等.云南双江勐库野生古茶树群落[J].茶叶，2003，29(4) : 220-221.

ZHANG J， WANG P S， CHEN H W， et al. Wild tea populations in Shuangjiang Mengku of Yunnan Province[J].JournalofTea， 2003，29(4) : 220-221. (in Chinese with English abstract)

[10]萧力争，晏嫦妤，李家贤，等.凤凰单丛古茶树资源的遗传多样性AFLP分析[J].茶叶科学，2007，27(4) : 280-285.

XIAO L Z， YAN C Y， LI J X， et al. AFLP analysis on genetic diversity of Fenghuang-Dancong tea plant germplasms[J].JournalofTeaScience，2007，27(4) : 280-285.(in Chinese with English abstract)

[11]季鹏章，张俊，王平盛，等.云南古茶树(园)遗传多样性的ISSR分析[J].茶叶科学，2007，27(4) : 271-279.

JI P Z， ZHANG J， WANG P S， et al. Genetic diversity of ancient tea plant in Yunnan Province of China revealed by inter-simple sequence repeat(ISSR) polymerase chain reaction[J].JournalofTeaScience， 2007，27(4) : 271-279.(in Chinese with English abstract)

[12]何军，黄亚琴，庹小清，等.沿河古茶树不同投叶量与不同杀青温度对品质的影响[J].贵州茶叶，2011，39(1):36-37.

HE J，HUANG Y Q， TUO X Q， et al. Influence of the tea quality in the amount leaves of different investment and different fixing temperature for ancient tea trees in Yanhe[J].GuizhouTea， 2011，39(1):36-37.(in Chinese with English abstract)

[13]周玉璠，邹新球，刘德荣，等.武夷山古茶树的性状及品质特征：武夷山古茶树考察报告[J].福建茶叶，2008(1):38-39.

ZHOU Y F， ZOU X Q， LIU D R， et al. Characteristics and quality characteristics of ancient tea in Wuyishan: An investigation report on the ancient tea tree in Wuyishan[J].GuizhouTea， 2008(1):38-39.(in Chinese)

[14]王守生，成明昊，梁国鲁，等.蒙山古茶树的性状与其茶叶品质[J].茶叶通讯，2002 (4): 24-26.

WANG S S， CHENG M H， LIANG G L， et al. The characteristics of the ancient tea tree in Mengshan and its tea quality[J].TeaCommunication， 2002 (4): 24-26.(in Chinese)

[15]尹杰，牛素贞，宋勤飞，等. 黔西南州野生茶树的性状特征及品质分析[J]. 浙江农业学报，2013，25(4):782-786.

YIN J， NIU S Z， SONG Q F， et al. Analysis on the leaf bud characters and biochemical components in the spring shoots of wild tea plant from Qianxinan[J].ActaAgriculturaeZhejiangensis， 2013，25(4):782-786. (in Chinese with English abstract)

[16]王秋霜，凌彩金，刘淑媚，等.花青素分离纯化及其组分鉴定研究进展[J].食品工业科技，2013(3):358-360.

WANG Q S， LING C J， LIU S M， et al. Research progress in separation purification and component identification of anthocyanins[J].ScienceandTechnologyofFoodIndustry，2013(3):358-360. (in Chinese with English abstract)

[17]AWIKA J M， ROONEY L W， WANISKA R D. Anthocyanins from black sorghum and their antioxidant properties[J].FoodChemistry， 2004，90(1/2):293-301.

[18]孙建霞， 张燕，孙志健，等.花色苷的资源分布以及定性定量分析方法研究进展[J]. 食品科学， 2009， 30(5): 263-268.

SUN J X， ZHANG Y， SUN Z J， et al. Summary of resource distribution and qualitative and quantitative analysis methods of anthocyanin[J].FoodScience， 2009， 30(5): 263-268. (in Chinese with English abstract)

[19]费旭元.紫娟茶中花青素的提取分离及抗氧化活性研究[D].北京：中国农业科学院，2012.

FEI X Y. Study on extraction and separation of anthocyanins from “Zijuan” tea and their antioxidant activity[D]. Beijing: Chinese Academy of Agricultural Sciences， 2012. (in Chinese with English abstract)

[20]TERAHARA N， TEKEDA Y， NESUMI A， et al. Anthocyanins from red-ower tea (Benibana-cha)，Camelliasinensis[J].Phytochemistry， 2001， 56(3): 359-361.