不同贮藏温度下鲈鱼腐败菌生长动力学与货架期预测

蓝蔚青　张皖君　段贤源　吴启月　卢　瑛　谢　晶

(1.上海海洋大学食品学院， 上海 201306； 2.上海水产品加工及贮藏工程技术研究中心， 上海 201306)

(1/λ)1/2=bλ(T-Tminλ)

0　引言

鲈鱼(Lateolabraxjaponicus)为鲈形目真鲈科花鲈属经济鱼类，其肉质白嫩，营养丰富。由于鱼肉中的水分和蛋白质含量高，组织脆弱，极易受微生物生长的影响而发生腐败变质。鲜鱼流通期间，在腐败过程中逐渐占据优势、并产生异味代谢产物的小部分微生物，被称为该产品的特定腐败菌(Specific spoilage organism，SSO)[1-2]。SSO生长变化与鱼肉腐败速度密切相关，因此建立与鲈鱼品质高度相关的腐败菌生长动力学模型，预测其贮藏货架期，是预防鱼肉腐败变质的可靠而迅速的手段之一[3]。

低温保鲜可降低水产品中微生物的增殖速率，是淡水鱼最常用的贮存和保鲜方法，利用不同低温保鲜方式模拟温度对水产品品质及微生物生长变化的影响更契合实际。目前，一级模型中修正的Gompertz方程和Logistic方程在微生物动力学研究中应用较广泛，二级模型用于表达不同环境因素(如pH值、温度、水分活度等)对微生物增殖的影响。温度是影响鱼肉腐败菌生长的最重要因子，常用Belehradek方程与Arrhenius方程描述其与微生物动力学参数的最大比生长速率(k)和延滞时间(λ)的关系[4-5]。不同研究对象描述其腐败程度的模型存在差异，POWELL等[6]研究表明，Belehradek平方根方程能较好拟合0～10℃温度下气调包装大西洋鲑鱼中特定腐败菌的生长情况。LIU等[7]研究得出，Arrhenius方程对反映不同温度下虹鳟鱼片中菌落总数变化特点的拟合效果极佳，并能对0～9℃虹鳟鱼片的贮藏品质与剩余货架期进行更精准的预测。在生产流通中，受操作环境的影响，水产品在流通期间也会发生温度波动，对其品质造成严重影响。章志超等[8]模拟鲟鱼的断链流通温度，并以8℃和波动温度对模型进行验证，探究不同温度下鲟鱼中荧光假单胞菌的生长模型。刘寿春等[9]通过对比分析4℃恒温和0～4℃温度波动贮藏过程中冷却猪肉感官、理化和微生物特征的变化，表明温度波动对猪肉品质劣变速率和货架期均有不同程度的影响。

为将微生物生长预测模型应用到实际生产中，本文采用不同冰藏和冷藏方式模拟鲈鱼的实际流通环境，建立-1.8～10 ℃范围内的特定腐败菌生长动力学模型及货架期预测模型，并同时采用碎冰贮藏(0℃)与温度波动条件对预测模型的适用性进行验证，以期为快速预测鲈鱼在流通过程中的品质与货架期提供理论依据。

1　材料与方法

1.1　原料处理

鲜活鲈鱼(Lateolabraxjaponicus)60条，质量为(500±20)g，购自上海市浦东新区工商超市，挑选个体均一鱼样，30 min内运往实验室进行实验。

将鲜鲈鱼放入盛满碎冰的泡沫箱中，使其窒息死亡，经去头去尾去内脏处理，用蒸馏水清洗、沥干后装入自封袋中，分成5组。为贴近实际生产应用，实验模拟了鲜鲈鱼的不同流通条件，具体如图1所示(图中n表示所用鲈鱼样品条数)。

图1　实验设计流程图Fig.1　Flowchart of experimental design

其中，模拟流通组鲈鱼在捕获后先经流化冰预冷(-1.8℃)4 h，后置于无冰泡沫箱中模拟运输(0.8℃)8 h，当天到达超市后利用碎冰进行贮藏销售(0℃)至23 d。取样周期为流化冰处理组、碎冰处理组与模拟流通组(即波动温度)每2 d测定1次，冷藏处理组与常温处理组每天测定1次，各组指标至少重复3次。流化冰、碎冰处理组样品置于冷藏柜中，根据需要及时更换补充冰，保持体系温度恒定。采用数显温度记录仪测定贮藏过程中冰箱温度与鱼肉温度。流化冰由80%冰与20%水组成，盐水质量浓度为3.3 g/mL，利用RE-1000W-SP型流化冰机制取冰浆。

1.2　主要药品试剂

NaCl，中盐长江盐化有限公司；平板计数琼脂(PCA)培养基、假单胞菌CFC选择性培养基、含铁琼脂(IA)等，国药集团化学试剂有限公司。

1.3　主要仪器设备

RE-1000W-SP型流化冰机，南通瑞友工贸有限公司；MLS-3750型灭菌锅，日本SANYO公司；生化培养箱，上海一恒科学仪器有限公司；Testo-176T4型德图电子温度记录仪，德国仪器国际贸易(上海)有限公司。

1.4　实验方法

1.4.1微生物计数

细菌总数(TVC)、假单胞菌和希瓦氏菌数均参照文献[10]测定。称取10 g鱼肉于灭菌袋中，加入90 mL 0.85%无菌生理盐水，拍打均匀后以10倍梯度稀释，根据不同贮藏时间，取3个合适的稀释度，每个稀释度取1 mL置于无菌培养皿内，每个稀释度作3个平行。其中，PCA培养基测定TVC，在(30±1)℃下培养72 h计数。灭菌后的假单胞CFC选择性培养基冷却至50℃，加入假单胞菌CFC选择性培养基添加剂，摇匀后倒入平板。IA培养基测定希瓦氏菌，其均在(30±1)℃下培养48 h计数。

1.4.2感官分析

参考朱志伟等[11]法，稍作修改，感官评价采用质量指标法(Quality index method，QIM)。由7名专业培训的评定人员，随机抽取不同时期的鲈鱼鱼肉样品，对其光泽度、通透性、颜色、表面粘液、气味与质地等方面进行分析，为确保实验的一致性，所用鱼片均取自鱼体背部肌肉。QIM法中不同参数的分值范围在0～3，其中0为最佳品质，3或每个参数的最高分代表最低品质，将各参数分值相加，得出最终质量指标(QI值)。

1.4.3总挥发性盐基氮值

总挥发性盐基氮值(TVB-N)含量参照文献[12]测定。

1.4.4特定腐败菌生长动力学模型的建立

利用修正的Gompertz模型[13]描述不同温度下鲈鱼特定腐败菌的生长动态，公式为

lgN(t)=lgN0+lg(Nmax/N0)·
exp(-exp(2.718k/lg(Nmax/N0)(λ-t)+1))

(1)

式中t——时间，h

N(t)——t时菌数，CFU/g

Nmax——最大菌数，CFU/g

N0——初始菌数，CFU/g

k——微生物生长的最大比生长速率，h-1

λ——微生物生长的延滞时间，h

二级模型主要描述温度与微生物生长动力学参数(k和λ)的关系。采用Belehradek平方根方程[14]、Arrhenius方程[15]描述温度对微生物最大比生长速率k和延滞期λ的影响。Belehradek方程为

(1/λ)1/2=bλ(T-Tminλ)

(2)

k1/2=bk(T-Tmink)

(3)

式中b——常数T——温度，K

Tmin——假设的概念，指最大比生长速率为零时的温度

Arrhenius方程为

lnk=lnk0-Eak[1/(RT)-1/(RTref)]
ln(1/λ)=ln(1/λ0)-Eaλ[1/(RT)-1/(RTref)]

(4)

式中R——通用气体常数，J/(mol·K)

Tref——基准温度，取273 K

k0——Tref时的最大比生长速率，h-1

λ0——Tref时的延滞时间，h

Eak——k的活化能，kJ/mol

Eaλ——λ的活化能，kJ/mol

1.4.5生长预测模型的可靠性评价

采用偏差度Bf和准确度Af来评价已建立的微生物生长动力学预测模型可靠性，Bf、Af为1.0，表示模型预测值与实测值完全吻合。偏差度和准确度公式为

(5)

(6)

式中NMV——实测特定腐败菌数量

NPV——同一时间由微生物生长动力学模型得到的腐败菌数量预测值

n——重复次数

1.4.6鲈鱼货架期预测与评价

根据已建立的-1.8～10℃温度范围内特定腐败菌的生长动态模型，由鲈鱼特定腐败菌从初始菌数增至感官拒绝点时最小腐败菌数的时间进行货架期预测。将碎冰处理组与模拟流通组的鲈鱼货架期实测值与模型预测值进行比较，通过相对误差评价预测模型的准确性。

2　结果与分析

2.1　优势腐败菌数与最小腐败量确定

为准确预测鲜鲈鱼的货架寿命，需确定鲈鱼的SSO数量与最小腐败量Ns，即鱼肉鲜度在感官拒绝时的特定腐败菌数[16]。其中，图2是采用修正的Gompertz方程回归分析得到不同贮藏温度下鲈鱼的菌落总数、希瓦氏菌数和假单胞菌数生长规律。

图2　鲈鱼在不同贮藏温度下希瓦氏菌数、假单胞菌数和细菌总数的变化Fig.2　Changes of Shewanella, Pseudomonas and TVC growth of Lateolabrax japonicus stored at different temperatures

由图2可见，新鲜鲈鱼贮藏初期的微生物数量虽不多，但随着贮藏时间的延长，其希瓦氏菌、假单胞菌数逐渐接近总菌数，成为优势菌。王慧敏等[17]研究确定鲈鱼在微冻与冷藏下的主要优势腐败菌是希瓦氏菌和假单胞菌。由表1得出，鲈鱼4种温度下货架期终点(即感官拒绝点)时的QI值集中在9～10，此时鱼肉气味和质地已不符合消费者食用要求。TVB-N质量比为(20.45±3.77) mg/(100 g)，达到文献[18]的卫生标准，说明当微生物数超过上述数量级时，鱼样可能已腐败。因此，可认定希瓦氏菌、假单胞菌的最小腐败量Ns为(6.48±0.41) lg CFU/g与(6.33±0.36) lg CFU/g，根据希瓦氏菌与假单胞菌的生长规律可预测鲈鱼的贮藏货架期。

表1　不同贮藏温度下鲈鱼初始及货架期终点时的SSO数、TVB-N质量比和QI值Tab.1　SSO counts, TVB-N and QI values at beginning and end of storage time in Lateolabrax japonicus stored at different temperatures

2.2　鲈鱼特定腐败菌的生长曲线

图3为在模拟鲈鱼4种流通温度(-1.8、0、4、10℃)下得到的假单胞菌及希瓦氏菌生长实测值，通过采用修正的Gompertz方程对微生物生长曲线进行拟合。

由表2可知，拟合的决定系数R2较高，均大于0.93，生长曲线都呈现出典型“S”型特征，说明修正的Gompertz方程能准确描述不同温度下假单胞菌和希瓦氏菌随时间的变化规律。张新林等[19]在三文鱼荧光假单胞菌的研究中也有类似结论。两种腐败菌的初始菌数在3～4 lg CFU/g，表明样品新鲜，符合实验预期值，稳定期的最大菌数在6.34～8.30 lg CFU/g。-1.8℃的假单胞菌、希瓦氏菌最大比生长速率k为0.012 6、0.011 9 h-1，延滞期λ分别为217.20、269.28 h。随着温度的升高，两种菌的最大比生长速率逐渐增大，延滞期缩短，表明温度对特定腐败菌的生长有较大影响[5]。低温降低了微生物体内酶的活性，抑制其生长速率，延长增殖适应期，说明流化冰的微冻处理对鲈鱼腐败菌生长有明显抑制作用。

图3　不同贮藏温度下鲈鱼肉中假单胞菌、希瓦氏菌的生长曲线Fig.3　Growth curves of Pseudomonas and Shewanella in Lateolabrax japonicus stored at different temperatures

微生物种类贮藏条件温度/℃R2λ/hk/h-1Nmax/(lgCFU·g-1)流化冰-1.80.9758217.200.01266.34假单胞菌碎冰00.9605201.120.01737.46冷藏140.9724102.480.02238.09冷藏2100.978648.000.04978.05流化冰-1.80.9325269.280.01196.76希瓦氏菌碎冰00.9576143.520.01117.49冷藏140.9669118.800.02048.30冷藏2100.983764.560.05647.41

图4　Belehradek方程中温度对特定腐败菌最大比生长速率(k)、延滞期(λ)的影响Fig.4　Effect of temperature on maximum specific growth rate (k) and lag phase (λ) of SSO with Belehradek equation

2.3　温度对微生物生长动力学参数的影响

应用二级模型Belehradek 方程和Arrhenius方程描述温度T与Gompertz方程所得的特定腐败菌最大比生长速率k和延滞期λ的关系。

从图4可知，Belehradek方程对两种特定腐败菌的k、λ决定系数均大于0.90，表现出良好的线性关系，说明Belehradek 方程能很好描述温度对微生物k和λ的影响，反映鲈鱼优势腐败菌随温度变化而呈现出的规律。国内相关人员[8, 20]研究假单胞菌在草鱼、鲟鱼等的生长数据也得到类似结论。

温度T与鲈鱼假单胞菌最大比生长速率k和延滞期λ的Belehradek方程为

k1/2=0.008 9T+0.127 0
(1/λ)1/2=0.006 6T+0.075 5

T与希瓦氏菌k和λ的Belehradek方程为

k1/2=0.011 2T+0.115
(1/λ)1/2=0.004 9T+0.075 6

由图5可知，Arrhenius方程除对希瓦氏菌λ的拟合度(R2>0.877 6)较小外，其余R2均较大(R2>0.92)。

图5　Arrhenius方程中温度对特定腐败菌最大比生长速率(k)、延滞期(λ)的影响Fig.5　Effect of temperature on maximum specific growth rate (k) and lag phase (λ) of SSO with Arrhenius equation

其中，温度与鲈鱼假单胞菌k和λ的Arrhenius方程为

lnk=-8 326.19/T+26.35
ln(1/λ)=-9 958.75/T+31.28

T与希瓦氏菌k和λ的Arrhenius方程为

lnk=-10 444.35/T+33.91
ln(1/λ)=-8 091.00/T+24.43

2.4　微生物生长预测模型的建立与可靠性评价

为使建立的模型更具实用性与可靠性，结合鲈鱼实际流通环境，本实验以碎冰贮藏(0℃)和波动温度条件下的特定腐败菌实测值验证生长预测模型的准确性。ROSS[21]曾提出Bf值的划分标准：0.901.15，模型为不可接受。Af值越小(大于1)，模型预测的准确性越高。

由表3可知，0℃和波动温度下基于Belehradek方程得出的假单胞菌、希瓦氏菌生长预测模型的Bf分别为0.951 0、0.993 6和0.982 1、1.024 2，处于模型最佳范围，Af分别为1.042 5、1.084 5和1.093 4、1.107 5，模型的预测误差绝对值在4.25%～10.75%，表明建立的模型能很好预测鲈鱼特定腐败菌在0℃和波动温度下的生长规律。而基于Arrhenius方程所得的假单胞菌、希瓦氏菌的预测模型的Bf处于模型可接受范围，预测误差绝对值在9.55%～21.66%，因此，基于Belehradek方程的生长预测模型对腐败菌的预测效果更好。

表3　波动温度条件下特定腐败菌生长模型预测的偏差度和准确度Tab.3　Bias and accuracy factors from different models of growth value of SSO under non-isothermal conditions

2.5　鲈鱼剩余货架期模型建立与评价

由表1已知假单胞菌、希瓦氏菌的初始菌数(N0)和最小腐败值(Ns)，利用修正的Gompertz方程结合2.3节的温度T与最大比生长速率k和延滞期λ的Belehradek方程得出鲈鱼在-1.8～10℃下的货架期预测模型

(7)

(8)

同理，结合2.3节的温度T与k和λ的Arrhenius方程得出鲈鱼在-1.8～10℃下的货架期预测模型

(9)

(10)

表4是鲈鱼特定腐败菌在0℃和波动温度条件下预测值和实际值比较，其中由Belehradek方程得到的货架期预测模型对假单胞菌、希瓦氏菌的预测相对误差为-4.96%、-8.81%和-7.30%、-5.02%，绝对值在0～10%范围内，表明预测模型准确度较好。由Arrhenius方程得到的货架期预测模型对假单胞菌、希瓦氏菌的预测相对误差较大，其中希瓦氏菌达19.37%，说明由Belehradek方程所得货架期模型预测效果更佳。

表4　波动温度条件下货架期预测模型的验证Tab.4　Validation of shelf life prediction models under non-isothermal conditions

3　结论

(1)修正的Gompertz方程能较好描述-1.8～10℃下鲈鱼假单胞菌和希瓦氏菌的生长情况，拟合决定系数R2均达0.93以上。在Belehradek方程下，温度与希瓦氏菌和假单胞菌最大比生率(k)和延滞期(λ)呈良好线性关系，R2均大于0.90，拟合效果优于Arrhenius方程，反映了低温对特定腐败菌生长的抑制效果。

(2)基于Belehradek方程所建鲈鱼温度模型在-1.8～10℃范围内预测误差较小，位于模型最佳范围，且剩余货架期预测模型的相对误差绝对值在0～10%，比Arrhenius方程建立的生长预测模型和货架期模型准确。

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