试验方法和接种物来源对苯甲酸钠快速生物降解率的影响

邓桂荣，刘洪英，梅承芳，张宏涛，柳燕贞，曾国驱,*

1. 广东省微生物分析检测中心, 生态毒理与环境安全实验室，广州 510070 2. 广东省微生物研究所, 广东省菌种保藏与应用重点实验室，广州 510070 3. 省部共建华南应用微生物国家重点实验室, 广州 510070 4. 环境保护部固体废物与化学品管理技术中心, 北京 100029

随着科学技术的飞速发展和经济水平的快速提高，新化学物质的种类和数量增加的速度越来越快。据悉，全球每年有1 000～2 000种新化学物质问世[1]，以商业目的在我国出现的现有化学物质近4.6万种[2]。这些化学品在提高人们生活质量的同时，进入环境后对人类健康和生态系统都存在着不同程度的安全隐患。因此，通过各种技术手段了解化学品在环境中的归趋非常重要。而在这些化学品的生态毒理风险评估中，快速生物降解性测试扮演着不可或缺的角色。

早在2008年，欧盟实施的《关于化学品注册、评估、许可与限制(REACH)法规》和EC 440 2008法规已将国际上普遍采用的经济合作与发展组织(Organization for Economic Co-operation and Development, OECD)的6种经典快速生物降解性测试方法[3]写入技术法规，要求进口到欧盟成员国的化学品提交这些测试数据[4]。而为了保障化学品对生态环境的安全，我国新化学物质登记制度规定在我国境内从事研究、生产、进口和加工使用的新化学物质必须提交基于这6种方法的快速生物降解性数据[5-6]。由此可见化学品快速生物降解性测试在生态毒理测试中的重要地位。

然而，在实践中发现，采用同一来源接种物、不同快速生物降解性试验方法对同一受试物进行测试时，所得结果可能存在较大差异。李斯颖[7]认为是接种物浓度和分析方法不同所致。而采用同一试验方法、不同来源接种物测试同一受试物时，也出现重现性和可比性差的情况。Ginkel等[8]、Vázquez-Rodríguez等[9]、Dechrugsa等[10]和Mezzanott等[11]指出这是由于不同来源的接种物的组分尤其是微生物种群差异较大。重现性和可比性的不足严重影响了测试数据和结果的可靠性，容易延误新化学物质的正常申报，增加了新化学物质进入环境后潜在风险的不确定性。因此，探究试验方法、接种物来源以及两者的交互效应对受试化学品生物降解率的影响具有重要的实用价值。

本文以广州地区2个主要处理生活污水的污水处理厂为接种物来源，以《化学品测试方法》[12]推荐的阳性参照物苯甲酸钠为受试物，从2013年至2015年，分别采用OECD快速生物降解性301系列试验方法[13]中较为广泛应用的方法(301B：CO2产生试验[14]、301D：密闭瓶法试验[15]和301F：测压呼吸计量法试验[16])，测试苯甲酸钠14 d生物降解情况，共获得89个标准化测试数据。采用SPSS软件进行分析，考察了试验方法、接种物来源以及两者的交互效应对苯甲酸钠生物降解率的影响，以期为测试机构开展可快速生物降解类新化学物质试验时选择试验方法和接种物来源提供有益的参考。

1　材料与方法(Materials and methods)

1.1　受试物

苯甲酸钠(≥99.5%)，分析纯，购自广州化学试剂厂。

1.2　仪器

数显滴定仪(Titrette，德国，BRAND GMBH + CO KG)，溶解氧测定仪(Multi 3430，德国，WTW)，测试系统(OxiTop®Control，德国，WTW)，生化培养箱(SHP-350，中国，上海精宏实验设备有限公司)。

1.3　接种物

根据测试标准，接种物取自广州地区2家主要处理生活污水且运行状况良好的污水处理厂(DTS和LD)。301B和301F试验取用位于曝气池末端的活性污泥，经过清洗、混合液悬浮固体浓度(Mixed Liquor Suspended Solids，MLSS)[17]测定、重新悬浮等一系列处理后，得到活性污泥浓度为4.0 g·L-1(以干重计)的接种物。301D试验则直接取用二级出水为接种物。

1.4　试验条件

301B：(22±2) ℃；301D：(20±1) ℃；301F：(22±1) ℃。试验过程中均保持黑暗。

1.5　方法

按照我国化学品测试导则[12]和《化学品测试方法》[3,13]中的标准条件进行试验，每组试验方法均包括了空白对照组、受试物处理组。空白对照组仅含接种物，受试物处理组包含苯甲酸钠和接种物。由于已知苯甲酸钠不会对接种物中的微生物产生毒性效应，因此不设置毒性对照组。按照不同方法的要求设置每个处理组的平行数。

所有试验均遵循GLP规范的要求[18-19]，操作步骤按照标准操作程序(SOP)的规定实施。

1.6　数据统计

采用Microsoft Office Excel 2007统计苯甲酸钠的生物降解率后，应用SPSS Statistics 17.0软件对各组试验数据进行方差分析和多重比较检验(LSD法)，统计显著水平设为P=0.05。

2　结果与分析(Results and analysis)

2种接种物来源进行3种试验方法的快速生物降解性测试共计89个，测试数量及分布如表1所示。

以苯甲酸钠生物降解率为自变量，分别以试验方法和接种物来源为因变量进行方差齐性检验，计算得Sig.依次为0.850和0.557，大于0.05，因此认为各试验方法和各接种物来源对应的苯甲酸钠生物降解率方差相等。

表1　试验数量汇总表Table 1　Summary of test number

2.1　同一试验方法不同来源的接种物对苯甲酸钠生物降解率的影响

由表2可知，以不同来源的接种物，采用同一试验方法测试苯甲酸钠生物降解率时，两者差异并不明显。使用这2种接种物的301B试验，对苯甲酸钠的生物降解率边际均值分别为74.3%和75.2%，301D试验相应的均值为78.7%和78.8%，301F试验相应的均值则为87.1%和82.0%。表3主效应方差分析结果显示，来自这2个生活污水处理厂的接种物对苯甲酸钠生物降解率影响的显著性概率Sig.为0.472，远大于显著性水平(P>0.05)，由此可以推断接种物来源对苯甲酸钠生物降解率无显著影响。

2.2　不同试验方法同一接种物来源对苯甲酸钠生物降解率的影响

由表3可知，选择不同的试验方法对苯甲酸钠的生物降解率影响的Sig.为0.000，说明当使用同一来源的接种物，采用不同的试验方法进行测试时，苯甲酸钠的生物降解率数据差异显著。但各试验之间的差异情况有别。表4表明，采用DTS接种物进行试验，301B和301D，301B和301F，301D和301F的Sig.依次为0.291、0.002和0.035。在显著性水平P=0.05下，可以认为301B和301D这2种不同试验方法对苯甲酸钠生物降解率影响的差异较小，而301B和301F，301D和301F之间确实存在显著的差异。当采用LD接种物进行试验时，301B和301D，301B和301F，301D和301F的Sig.依次为0.163、0.002和0.122，在显著性水平P=0.05下，仅301B和301F之间出现了显著性差异。而301B和301D，301D和301F之间的Sig.均大于显著性水平，可认为两者的苯甲酸钠生物降解率的差异不明显。

2.3　试验方法和接种物来源的交互效应对苯甲酸钠生物降解率的影响

图1横坐标代表3种试验方法，纵坐标代表苯甲酸钠的生物降解率边际均值估计，2条折线反映试验方法与接种物来源的交互效应下，苯甲酸钠的生物降解率边际均值的增减交叉变动情况。图中折线存在交叉现象，表明试验方法和接种物来源具有交互效应。通过两者关系的进一步分析可知(见表3)，其F值为1.205，Sig.为0.305，大于0.05，说明试验方法和接种物来源的交互效应并不显著。

表2　试验方法和接种物来源的边际均值估计Table 2　Estimated marginal means of inoculum sources and test methods

表3　主效应方差分析表Table 3　Tests of between-subjects effects

注：a表示R2= 0.231(经调整的R2= 0.184)。

Note: a. R Squared =0.231 (Adjusted R squared =0.184).

表4　试验方法多重比较分析表Table 4　Multiple comparisons of test methods

注：*表示均差差值在0.05水平上显著。

Note:*The mean difference is significant at the 0.05 level.

图1　苯甲酸钠生物降解率估计边际均值折线图Fig. 1　Line chart of estimated marginal means of sodium benzoate biodegradation rate

3　讨论(Discussion)

随着人们对生活的要求日益提高，环保部门对化学品污染问题越来越重视，快速生物降解性测试的应用越来越广泛，实验室之间甚至实验室内部同一受试物生物降解率的重复性和可比性差的问题急需解决，已引起化学品管理部门和测试机构的高度关注。一般认为，造成这一现象主要有三大原因：一是接种物未能统一、规范化。杨倩等[20-21]研究指出，接种物易受到污水处理厂本身运行工艺、区域性的自然经济环境以及人们生活习惯等因素影响，微生物群落结构呈现差异性，进而影响到试验的重复性及结果间的可比性。这点在本文中未得到印证，根据长期的实践经验，推测可能是因为苯甲酸钠本身就具有快速生物降解性，在环境中可迅速降解，被列为"易生物降解"类物质，该类物质受到接种物来源的影响较小，容易获得一致的结果。而当受试物仅具有中等快速生物降解性，特别是10 d观察期内生物降解率在60%上下浮动时，接种物来源的影响效应更加明显。二是试验方法本身的影响。同样是快速生物降解性试验，但采用不同的试验方法，可能得到截然不同的结果。梅承芳等[22]通过4,4’-二氨基二苯甲烷(4,4’-diaminodiphenylmethane，MDA)的301A、B、D和F的快速生物降解性测试发现，301F的生物降解率最高，为100%，而最低的301D为0%，两者差异高达100%。出现此类情况的原因是多方面的，例如接种物浓度、试验系统构成和评价方法等。因此，选择试验方法时，在满足受试物的水溶性、挥发性和吸附性的条件下，尽量选择可能得到高生物降解率的方法，可能更能表征受试物在实际环境中的快速生物降解性能。三是目标受试物分子结构影响。有观点认为，有机化学品的分子结构参数可能影响其快速生物降解性[23-24]。不可否认，化学品生物降解是一个极其复杂的过程。比如，有些化学品在水体中会产生新的中间产物，直到试验结束，该中间产物并没有最终降解，导致以试验开始和结束时试验系统中的母体受试物计算的生物降解率与以生物需氧量(biochemical oxygen demand, BOD)计算的生物降解率有较大差别。这需要在日常的工作实践中认真观察，善于总结，才能更好地甄别。

测试结果重复性和可比性差，直接制约着新化学物质潜在环境风险的准确预判。本研究中，仅选择3种快速生物降解性试验方法，所用接种物仅来自2个城市生活污水处理厂，来源相对单一，区域性较强，而且仅以具有快速生物降解性的苯甲酸钠为研究对象，存在一定的局限性。为了进一步系统地探明试验方法、接种物来源以及两者的交互效应对受试物最终快速生物降解性的影响情况，有必要在此基础上选择不同降解特性的受试物，同时选用另外3种快速生物降解性经典测试方法，并且在满足测试方法要求的前提下，取自全国不同地区不同性质的接种物，深入研究不同试验方法和不同来源的接种物对化学品快速生物降解测试结果的作用机制，无论是对于新化学物质测试机构正确选择试验方法和接种物来源，还是对于政府管理部门准确管控新化学物质的环境风险，都具有重要的指导意义。

本研究结果表明，当受试物为易生物降解时，接种物来源、试验方法和接种物来源的交互效应对该受试物的生物降解率无显著的影响，但在同一条件下，选择不同的试验方法往往会导致最终生物降解率出现明显差异。

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