酸奶生产中噬菌体污染的判断及防治

李海涛，王慕华，赵玉明，杜盈，张国柱，宫俊峰

(1.山西维尔生物乳制品有限公司，太原030006；2.山西省生物研究所，太原030006)

0 引言

在酸奶生产过程中，噬菌体污染常有出现[1-2]。噬菌体污染发生后，轻则发酵菌种生长受阻，产酸、产粘能力下降，酸奶不凝固，酸奶的风味、营养下降；重则使酸奶发酵无法继续进行，生产被迫停止，给乳制品行业带来巨大危害[3-4]。常见的噬菌体防治方法有环境净化、更换生产菌株、抗噬菌体菌株选育等[5-6]。本文从生产实际出发研究了酸奶异常发酵时噬菌体污染的初步判断及不同防治措施的效果，为今后酸奶生产中噬菌体污染的预防与应对提供合理的解决方法。

1 实验

1.1 材料

1.1.1 供试菌种

酸奶生产菌株：嗜热链球菌（Streptococcus therm ophilus，S.t.），保加利亚乳杆菌（Lactobacillusbu lgaricus，L.b）由本公司保藏。

嗜热链球菌抗噬菌体菌株，嗜热链球菌抗噬菌体菌株与保加利亚乳杆菌融合子由山西省生物研究所选育、保藏[2,7-8]。

噬菌体：从多次酸奶异常发酵液中分离获得。

1.1.2 培养基

M RS培养基：蛋白胨10 g，牛肉膏10 g，酵母提取物5 g，柠檬酸二铵2 g，乙酸钠5 g，葡萄糖20 g，M g-SO4·7H2O 0.58 g，M nSO4·4H2O 0.25 g，吐温80 lm L，蒸馏水1 000 m L，pH值6.2-6.4，固体培养基添加1.5%的琼脂。用于保加利亚乳杆菌的培养[9]。

M 17培养基：植质蛋白胨5.0 g，聚蛋白胨5.0 g，酵母提取物5.0 g，牛肉浸膏2.5 g，抗坏血酸0.5 g，β-甘油磷酸二钠19 g，1.0 m ol/L M gSO4·7H2O 1.0 m L,蒸馏水1000 m L，pH值7.1，固体培养基添加1.5%的琼脂。用于嗜热链球菌的培养[9]。

双层琼脂培养基：M 17培养基，下层加1.5%琼脂，上层加0.8%琼脂。

脱脂乳培养基：牛乳脱脂后115℃灭菌15 m in，冷却后置于冰箱冷藏备用。

1.2 测定方法

活菌数计算采用发酵液适度稀释涂平板计数；酸奶滴定酸度测定法按GB5409-85测定；黏度测定采用NDJ-1型旋转黏度计，取牛乳发酵后冷藏过夜的样品进行测定。

1.3 方法

1.3.1 噬菌体污染的初步判断

对发酵异常的酸奶产品进行乳清分离，将分离后的乳清分为2份，并将其中1份经95℃/15 m in杀菌并冷却至45℃以下备用。按配方要求配制适量牛奶并定容至配料总量的80%～90%，经95℃/5 m in杀菌并冷却至41～43℃后分成2份备用。分别用2份乳清将2份牛奶定容至100%，接入乳酸菌种（经过证实为未污染的与发酵异常酸奶所用的同型号菌种），进行42℃保温发酵培养。对2份产品的发酵过程进行跟踪比较，初步判定是否为噬菌体感染。

1.3.2 噬菌体污染的确定

噬菌体污染的确定采用双层平板法，将8 m L左右的1.5%琼脂含量的M 17培养基倒入无菌培养皿中，静置待凝固后备用。将异常发酵液10倍梯度稀释到合适梯度，吸取0.1m L敏感菌液和0.1m L的异常发酵液加入到5 m L灭菌试管中，加入熔化并冷却至45～50℃的0.8%琼脂含量M 17培养基4 m L，混合均匀，小心倒入准备好的下层平板上，注意不要弄出气泡，待上层凝固后，正置放入42℃培养箱中培养48 h，取出观察有无噬菌斑。

1.3.3 更换生产菌株及使用抗噬菌体菌株

噬菌体污染发生后，在酸奶生产车间使用20 L中试生产线，更换酸奶发酵菌种或使用抗噬菌体菌株，观察、跟踪酸奶的发酵情况。

1.3.4 环境净化

噬菌体污染发生后，彻底对发酵车间进行清洗和消毒，对管件连接处进行检查，防止出现清洗死角，完善和加强清洗消毒程序，确保地面上没有牛奶或乳清残留，在处理发酵产品和菌种时必须清洗和消毒双手及设备，严格执行作业区域管理，禁止无关人员进入发酵区域。

2 结果与讨论

2.1 噬菌体污染的初步判断

酸奶的异常发酵包括酸奶凝固时间延长，酸度、粘度下降，风味异常等，出现这种情况时就应及时进行是否为噬菌体污染的判断。排除抗生素，消毒剂和清洗剂残留，强氧化剂等影响，对比异常发酵液乳清对凝乳的影响，结果如图1和表1所示。

图1 添加异常乳清时活菌数

表1 异常发酵液对酸奶发酵的影响

由图1及表1可知，添加未灭菌的酸奶异常发酵液乳清，酸奶发酵时发酵菌株生长受阻，发酵酸奶不凝固，产酸、产黏能力大幅下降，由此可以初步判断酸奶发酵受到噬菌体污染。

2.2 噬菌体污染的确定

初步判断酸奶发酵受到噬菌体污染后，可进一步采用双层平板法进行确认，双层平板培养48 h后，如平板上出现噬菌斑，即可确定酸奶生产出现噬菌体污染。

2.3 更换生产菌株对防治噬菌体的影响

噬菌体污染发生后，更换生产菌株，生产3批次，每次发酵的活菌数及发酵结果如图2和表2所示。

图2 更换生产菌株后不同批次活菌数

表2 更换生产菌株不同生产批次酸奶发酵结果

由图2及表2可知，更换生产菌株后，短期内可以控制噬菌体的污染，这是因为噬菌体感染敏感菌株具有很强的专一性，更换菌株与敏感菌株在表面结构等方面存在差异，噬菌体污染暂时得到控制。但噬菌体结构简单，极易发生突变，生产几个周期后，噬菌体有可能变异，更换的菌株变为敏感菌株，污染再次发生。

2.4 使用抗噬菌体菌株对防治噬菌体的影响

目前公司保存的抗噬菌体菌株有两种，一种为针对近期噬菌体污染从敏感菌株嗜热链球菌中选育到的抗近期各种噬菌体的嗜热链球菌抗性菌株；一种为通过细胞融合技术，选育到的由嗜热链球菌抗噬菌体菌株与生产用保加利亚乳杆菌融合产生的生产性状优良的具有抗噬菌体能力的融合子。在噬菌体污染发生后，采用抗噬菌体菌株进行酸奶发酵3批次，发酵结果如图3、图4及表3所示。

由图3、图4及表3可知，单纯的嗜热链球菌抗噬菌体菌株短期内对噬菌体防治有一定的效果，随着生产的连续进行，有可能抗性菌株发生回复突变，也有可能噬菌体变异，污染又会出现，且使用单一抗性菌株，酸奶性状不好[10]。使用抗多种噬菌体的融合子，3批次发酵未见污染且酸奶性状较好，这是因为融合子融合了双亲的特性且表面结构发生变化，在对抗噬菌体变异方面效果较好。

2.5 环境净化对防治噬菌体的影响

噬菌体污染后，对生产环境进行彻底整治，环境消毒每天进行，管道设备日日清洗、消毒，每天净化后进行发酵生产，3批次生产结果如图5和表4所示。

图3 单-抗噬菌体菌株不同批次活菌数

图4 融合子不同批次活菌数

表3 不同抗噬菌体菌株不同生产批次酸奶发酵结果

Rh：嗜热链球菌抗噬菌体菌株与保加利亚乳杆菌融合子

图5 环境净化后不同批次活菌数

表4 环境净化后不同生产批次酸奶发酵结果

由图5和表4可以看出，环境净化虽不能立竿见影消除污染，但还是有一定效果的。

2.6 环境净化结合更换生产菌株对防治噬菌体的影响

环境彻底净化后，更换生产菌株，生产3批次，结果如图6和表5所示。

图6 环境净化后更换菌株不同批次活菌数

表5 环境净化结合更换生产菌株不同生产批次酸奶发酵结果

由图6和表5可以看出，环境净化结合更换生产菌株可以很好地预防噬菌体污染且不影响酸奶品质。

3 结论

（1）噬菌体污染在酸奶生产中时有发生，污染发生后可通过异常发酵液在5 h左右快速初步判断是否为噬菌体污染，使企业能够及时做出反应，防止污染的进一步扩大，减少损失。

（2）污染发生后，防治噬菌体的有效途径有两条，一是环境净化结合更换生产菌株；二是筛选具有抗噬菌体能力且生产性状优良的融合子。这两种途径不仅可以有效的预防噬菌体污染，又不影响酸奶的品质。

参考文献：

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[2]王慕华,潘佩平,赵玉明,等.嗜热链球菌抗噬菌体菌株的选育及其发酵特性的研究[J].食品与发酵工业,2014,40(3):92-96.

[3]马成杰,吴正钧,程国军,等.酸奶生产中的噬菌体污染[J].江西农业学报,2007,19(7):90-91.

[4]李亚蕾,杨波,李文霞,等.抗噬菌体嗜热链球菌突变菌株Streptococcus thermophilus-21UD的选育[J].食品工业科技,2008,29(11):118-121.

[5]姜延龙,霍贵成.乳酸菌抗噬菌体机制研究进展[J].中国乳品工业,2005,(8):30-34.

[6]张秀红.溶源性发酵乳杆菌及其温和噬菌体的研究[D].山东大学，博士论文，2006.

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