白藜芦醇对人前列腺癌细胞株PC-3增殖、凋亡的影响及其机制

张万生，赵荣，田丰雨，侯建成，赵行宇

(吉林医药学院，吉林吉林132013)

还具有各广谱抗肿瘤活性，其对白血病、乳腺癌、卵巢癌等多种恶性肿瘤细胞具有明显的抑制作用[5～7]，但其抗前列腺癌的作用鲜有报道。本研究观察了不同浓度白藜芦醇对人前列腺癌细胞系PC-3增殖、凋亡的影响，并探讨其机制。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料 PC-3细胞由吉林医药学院科学实验室保存，并以含10%胎牛血清的RPMI1640培养基培养。白藜芦醇购自美国Sigma公司，纯度99%，购买的白藜芦醇溶于二甲基亚砜(DMSO)中，4 ℃储存。MTT、DMSO购于Sigma公司。兔抗人Bcl-2、Bax、cleave-Caspase-3、PARP和β-actin单克隆抗体及抗兔二抗均购自美国Santa Cruz公司。

1.2 细胞分组与白藜芦醇用法 将PC-3细胞分为对照组和实验1、2、3、4组。实验1、2、3、4组分别给予10、50、100、150 μmol/L的白藜芦醇处理24 h；对照组不加入药物。

1.3 细胞增殖抑制率测算 采用MTT法。将对数生长期的PC-3细胞以3×104/孔的终浓度接种到96孔板中。各组细胞加药处理24 h后，向每个孔中加入20 μL的MTT(5 mg/mL)。孵育4 h后，丢弃MTT培养基，将紫色甲臜晶体溶解于DMSO中。在570 nm处使用自动微孔板读数器测定对照组和各实验组孔中的光密度值(OD值)。按公式计算细胞增殖抑制率，细胞增殖抑制率=(1-实验组OD值/对照组OD值)×100%。实验重复3次，求均值。

1.4 细胞凋亡率测算 按细胞凋亡检测试剂盒进行操作。各组给药24 h后收集细胞并用冰冷的PBS洗涤2次。随后将细胞重悬于缓冲液中，并在Annexin V-FITC、PI中在室温下避光染色15 min。借助流式细胞术测算细胞凋亡率。

1.5 细胞凋亡相关蛋白检测 各组处理24 h后，搜集细胞并用冷PBS洗涤2次。将所得细胞用裂解缓冲液在冰上裂解10 min。4 ℃下以12 000 g离心10 min，将上清液转移到新鲜管中-70 ℃储存。用BDA检测试剂盒测定蛋白浓度。将50 μg蛋白质样品在10%SDS聚丙烯酰胺凝胶中电泳，随后转移到PVDF膜。在室温下，用Tris缓冲盐水中的5%非脂肪乳封闭膜2 h，然后加入P53、Cleave-Caspase-3、聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(PARP)(1∶5 000)及β-actin(1∶1 000)一抗，在Tris缓冲盐水中于4 ℃过夜。洗涤后加入二抗在室温下培养2 h。采用Image Pro Plus软件和电化学发光(ECL)系统，分析化学发光强度，以目的蛋白条带发光值与内参条带发光值的比值作为目的蛋白相对表达量。

2 结果

2.1 各组细胞增殖抑制率比较 白藜芦醇处理24 h后对PC-3细胞形态具有显著影响，主要表现为细胞数量减少，圆形细胞和细胞脱离，表明细胞死亡(图1)。对照组及实验1、2、3、4组OD值分别为0.998±0.165、0.683±0.131、0.565±0.090、0.375±0.108、0.285±0.070，各组OD值依次递减(P均<0.05)；实验1、2、3、4组细胞增殖抑制率分别为31.42%±10.13%、42.31%±12.76%、61.76%±12.72%、70.96%±8.29%，各实验组细胞增殖抑制率依次递增(P均<0.05)。可见白藜芦醇在处理24 h后对PC-3细胞具有显著的细胞毒作用，呈剂量依赖性，计算得IC50值为23.25 μmol/L。

图1 各组细胞给药24 h后形态

2.2 各组细胞凋亡率比较 对照组及实验1、2、3、4组细胞凋亡率分别为3.35%±0.62%、5.47%±0.87%、7.64%±1.25%、9.56%±1.55%、14.64%±2.21%，各组细胞凋亡率依次递增(P均<0.05)。

2.3 各组凋亡相关蛋白表达比较 实验1、2、3、4组细胞中P53、PARP(89 kD)相对表达量高于对照组，实验2、3、4组细胞中Cleave-Caspase-3相对表达量高于对照组，实验1、2、3、4组细胞中P53、PARP(89 kD)、Cleave-Caspase-3相对表达量依次增高(P均<0.05)。详见表1。

表1 各组细胞中凋亡相关蛋白相对表达量比较

注：与对照组相比，*P<0.05。

3 讨论

细胞凋亡是程序性细胞死亡过程，不论是在正常生长发育、组织结构改建中还是在肿瘤的发生发展中都非常重要。现已证实，由凋亡产生的损伤作用也是恶性肿瘤发展的关键特征之一[8]，诱导肿瘤细胞凋亡是有最有效的化疗策略[9,10]。细胞凋亡通常由内源和外源两种途径来介导[11,12]。在内源性途径中，Bax蛋白家族激活，作用于线粒体膜，细胞色素C释放，导致细胞凋亡[13～16]。抑癌基因P53的作用是增加Bax蛋白的表达从而启动内源性细胞凋亡途径[17]；通过Bcl蛋白家族导致Caspase通路激活，启动细胞凋亡。PARP可以结合DNA断端并修复DNA损伤，其也是Caspase作用的底物。Caspase激活后，PARP被剪切并产生PARP 89 kD片段，失去结合并修复损伤DNA的功能。剪切型PARP在细胞内表达上调，表明细胞凋亡过程已经启动，同时细胞的自身修复机制被抑制。

现有研究证明，白藜芦醇对白血病、乳腺癌、卵巢癌等多种恶性肿瘤细胞具有明显的抑制作用[18,19]。然而，鲜见白藜芦醇诱导前列腺癌细胞凋亡的报道，其诱导凋亡的分子机制也尚未阐明。为明确白藜芦醇的抗前列腺癌效应及其可能的分子机制，我们首先观察了白藜芦醇对PC-3细胞增殖的影响，结果显示，对照组及实验1、2、3、4组OD值依次递减，实验1、2、3、4组细胞增殖抑制率依次递增，表明白藜芦醇在处理24 h后对PC-3细胞具有显著的细胞毒作用，以剂量依赖性方式抑制PC-3细胞增殖。由于肿瘤细胞凋亡诱导是抗癌作用的主要观察指标[20]，为明确PC-3细胞增殖率的降低是否归因于细胞凋亡，我们又观察了白藜芦醇处理后细胞凋亡率变化，发现对照组及实验1、2、3、4组细胞凋亡率依次递增，说明白藜芦醇可能是通过诱导细胞凋亡来抑制PC-3细胞的增殖活力。

线粒体途径和死亡受体途径是化疗诱导肿瘤细胞凋亡的两个主要途径[21]。在线粒体途径中，抑癌基因P53起着至关重要的作用。本研究结果显示，实验1、2、3、4组细胞中P53、PARP(89 kD)相对表达量高于对照组，实验2、3、4组细胞中Cleave-Caspase-3相对表达量高于对照组，实验1、2、3、4组细胞中P53、PARP(89 kD)、Cleave-Caspase-3相对表达量依次增高，表明白藜芦醇处理PC-3细胞后P53、Cleave-Caspase-3蛋白表达水平上调，并加强PARP的片段切割。我们推测Caspase-3在PC-3细胞凋亡期间被激活，并通过作用于其底物PARP来促进细胞凋亡。

结合上述研究结果，我们认为，白藜芦醇可抑制PC-3细胞增殖并诱导细胞凋亡，作用呈剂量依赖性，凋亡诱导机制可能与P53表达上调、Caspase-3被激活、增加PARP的剪切有关。本研究结果为白藜芦醇用于前列腺癌的治疗提供了实验基础。

参考文献：

[1] Bray F, Sankila R, Ferlay J, et al. Estimates of cancer incidence and mortality in Europe in 1995[J]. Eur J Cancer, 2002,38(1):99-166.

[2]Jemal A, Siegel R, Ward E, et al. Cancer statistics,2009[J]. CA Cancer J Clin, 2009,59(4):225-249.

[3]Romero-Perez AI, Ibern-Gomez M, Lamuela-Raventos RM, et al. Piceid, the major resveratrol derivative in grape juices[J]. J Agric Food Chem, 1999,47(4):1533-1536.

[4] Baatout S, Derradji H, Jacquet P, et al. Increased radiation sensitivity of aneosinophilic cell line following treatment with epigalloca-techingallate, resveratrol and curcuma[J]. Int J Mol Med, 2005,15(2):337-352.

[5] 唐锐先,张巍,赵行宇.白藜芦醇诱导卵巢癌细胞SKOV-3的凋亡作用[J].中成药,2015,37(10):2293-2296.

[6] Le Corre L, Chalabi N, Delort L, et al. Resveratrol and breast cancer chemoprevention: molecular mechanisms[J]. Mol Nutr Food Res, 2005,49(5):462-471.

[7] Levi F, Pasche C, Lucchini F, et al. Resveratrol and breast cancer risk[J]. Eur J Cancer Prev, 2005,14(2):139-142.

[8] Pozo-Guisado E, Merino JM, Mulero-Navarro S, et al. Resveratrol-induced apoptosis in MCF-7 human breast cancer cells involves a caspase-independent mechanism with downregulation of Bcl-2 and NF-kappaB[J]. Int J Cancer, 2005,115(1):74- 84.

[9]Goldsmith KC, Hogarty MD. Targeting programmed cell death pathways with experimental therapeutics: opportunities in high-risk neuroblastoma[J]. Cancer Lett, 2005,228(1-2):133-141.

[10] Hu W, Zhang C, Fang Y, et al. Anticancer properties of 10-hydroxycamptothecin in a murine melanoma pulmonary metastasis model in vitro and in vivo[J]. Toxicol In Vitro, 2011,25(2):513-520.

[11] Scatena R, Bottoni P, Botta G, et al. The role of mitochondria in pharmacotoxicology: a reevaluation of an old，newly emerging topic[J]. Am J Physiol Cell Physiol, 2007,293(1):C12-C21．

[12] 郑婷婷,焦丽静,阙祖俊,等.中药诱导肿瘤凋亡相关机制研究进展[J].上海中医药杂志,2016,50(10):103-109.

[13] Hardwick JM, Soane L. Multiple functions of BCL-2 family proteins[J]. Cold Spring Harb Perspect Biol, 2013,5(2):8722．

[14] Wensveen FM, Alves NL, Derks Ingrid AM, et al. Apoptosis induced by overall metabolic stress converges on the Bcl-2 family proteins Noxa and Mcl-1[J]. Apoptosis, 2011,16(7):708-721．

[15] Anvekar RA, Asciolla JJ, Missert DJ, et al. Born to be alive:a role for the BCL-2 family in melanoma tumor cell survival, apoptosis, and treatmenMultiple functions of BCL-2 family proteinst[J]. Front Oncol, 2011,1(34):34．

[16] Chipuk JE, Parsons MJ, Green DR, et al. The BCL-2 family reunion[J]. Mol Cell, 2010,37(3):299-310

[17] Roy AM, Baliga MS, Elmets CA, et al. Grape seed proanthocyanidins induce apoptosis through p53, Bax, and caspase 3 pathways[J]. Neoplasia, 2005,7(1):24-36.

[18] 张倩,柏帅,李克文,等.白藜芦醇研究进展及现状[J].精细专用与化妆品,2017,25(10):39-41.

[19] Tyagi A, Singh RP, Agarwal C, et al. Resveratrol causes Cdc2-try15 phosphorylation via ATM /ATR-C hk1 /2-Cdc25C pathway as a central mechanism for S phase arrest in human ovarian carcinom a Ovcar-3 cell[J].Carcinogenesis, 2005,26(11):1978-1987.

[20]Debatin KM, Krammer PH. Death receptors in chemotherapy and cancer[J]. Oncogene, 2004,23(16):2950-2966.

[21] Fulda S. Apoptosis pathways and neuroblastoma therapy[J]. Curr Pharm Des, 2009,15(4):430-435.