粉状饲料中小麦粉碎粒度对肉鸡生产性能、消化器官发育和肠道健康的影响

钟丽梅，李东东，张克英，曾秋凤，白世平，王建萍，丁雪梅

（四川农业大学动物营养研究所/动物抗病营养教育部重点实验室，四川雅安 625014）

玉米作为传统的能量饲料广泛用于畜牧生产，近年来由于供需关系紧张，玉米的价格不断上涨，从而导致饲料成本不断增加。充分利用和开发现有饲料资源对畜牧生产具有重要的意义。小麦能量略低于玉米，但其粗蛋白质、氨基酸和非淀粉多糖等含量高于玉米，目前，小麦型饲粮已在生产中广泛使用。当小麦型饲粮中非淀粉多糖的问题被酶制剂减弱后，人们更关注如何通过饲料加工技术科学合理的使用小麦，而适宜的粉碎粒度是最关键的问题之一。研究表明，粉碎粒度是蛋鸡养殖能耗最大的部分[1]，也与动物生产性能和肠道健康有很大的关系[2-3]。粉碎粒度过大，在消化道内的消化率低，动物排泄的氮、磷等增加，污染环境的同时造成资源的极大浪费；而粒度过细，容易造成动物胃肠道疾病，损害机体的健康。有关粉碎粒度对家禽影响的研究主要集中在玉米的粉碎粒度上，关于小麦粉碎粒度对家禽的影响研究相对较少。本研究主要考察在添加木聚糖酶的情况下，不同小麦粉碎粒度对肉鸡生产性能、养分利用率、消化器官发育及肠道健康的影响，为小麦型饲粮在肉鸡中的合理应用提供参考。

1 材料和方法

1.1 试验设计

试验采用单因子设计，小麦通过5种孔径的筛片粉碎成2、4、6、8、10 mm共 5种粉碎粒度。试验为5个处理，每个处理7个重复，每个重复11只鸡，共选用385只AA肉公鸡。试验期42 d，分1～21 d和22～42 d两个阶段。

1.2 试验饲粮

试验采用小麦-豆粕型饲粮，粉状。饲粮营养水平参照中国鸡饲养标准（2004）肉用仔鸡营养需要结合生产中实际饲粮营养水平设定。饲粮组成及营养水平见表1。

1.3 饲养管理

试验在四川农业大学动物营养研究所试验场进行。试验肉鸡均采用网上平养（高0.5 m×宽1 m×长1 m）。试验前清洗鸡舍、笼具、料盘、料桶和饮水设备，然后用福尔马林和高锰酸钾（每立方米加30 mL福尔马林，15 g高锰酸钾）对其熏蒸48 h，开窗敞5 d后正式试验。入雏前24 h将鸡舍升温至32～35℃，此后温度每周降低2～3℃，直至保持在22～24℃为止。采用连续光照、自然通风、自由采食和自由饮水的管理方式。定期打扫圈舍卫生，常规免疫。

1.4 代谢试验

在试验第18～21天和 第39～42天进行代谢试验，代谢室预先用红外温控灯升到和试验饲养圈相同温度，分别在15 d和36 d 20：00，每个重复选一只接近均重的健康肉鸡，转移至代谢笼，预饲2 d并记录预饲期间的采食量。在17 d与38 d 20：00分别断料12 h，自由饮水到次日8：00。称取代谢试验所需饲料，代谢试验分别在18 d 8：00至21 d 8：00和39 d 8：00 至 42 d 8：00，自由采食和饮水，全收粪法连续3 d收集粪便，随排随收，小心去除羽毛、皮屑和杂物，计算损失料。排泄物鲜样于-20℃保存，最后将收集到的排泄物混合均匀，65℃烘干，24 h回潮，粉碎并过0.245 mm×0.245 mm筛，以重复为单位用封口袋封装，-20℃保存待测。

1.5 测定指标及方法

1.5.1 生产性能

分别于试验第22天和第43天提前12h断料，以重复为单位称重，空腹称量肉鸡体重和剩余料重，计算阶段体增重（BWG），阶段采食量（FI）和料重比（F/G）。

1.5.2 养分利用率

测定饲粮和排泄物中的干物质、粗蛋白质、粗脂肪、能量含量，并计算养分表观利用率和表观代谢能（AME），方法参照文献[4]。

表1 基础饲粮组成及与营养水平(风干基础)Table 1 Composition and nutrient levels of diets（air-dry basis）%

养分表观利用率（%）=100-（粪中养分含量×风干粪样重量）/（饲粮养分含量×采食量）×100。

AME=（食入总能-排泄物总能）/食入饲粮干物质量

1.5.3 消化器官发育

在试验第22天和第43天时，每个重复选择一只接近平均体重的鸡进行屠宰，迅速分离各组织器官。称取肝脏、胰脏、腺胃、肌胃的重量。计算消化器官指数。

1.5.4 空肠肠道形态

鸡屠宰后，分离空肠，在空肠中段处理剪下给1 cm的肠段，用0.9%的生理盐水洗净后放入10%甲醛固定液中固定。将固定好的空肠修理后用乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋进行切片，然后用苏木精-伊红（HE）染色、光学显微镜下观察。测量空肠绒毛高度、隐窝深度，肠黏膜厚度，并计算绒隐比。

1.5.5 空肠杯状细胞数

取4%多聚甲醛固定的空肠组织样品，用Moxvry（AB-PAS）染色法，对杯状细胞进行染色。具体方法参考操作步骤简述如下：切片脱蜡至水后，用3%醋酸液、阿利新兰液和3%醋酸液处理后，蒸馏水洗，再用0.5%过碘酸氧化后水洗，经schiff液染色后水洗，脱水、二甲苯透明、树脂胶封片。在400倍的视野下随机选10个视野，用Image Plus 5.0图像分析软件统计光密度值（IOD），将10个视野IOD值的平均值作为该张切片的统计结果。

1.5.6 空肠黏膜紧密连接蛋白基因相对表达量

使用总RNA试剂盒（Takara）RNAiso试剂盒（Takara，中国大连）。cDNA的合成采用primeScript RT试剂盒（Takara，中国大连），real-time PCR 采用SYBRPremixExTaq（Takara，中国大连）。采用Applied Biosystems7900HTReal Time PCR系统（Applied Biosystems，CA）进行PCR扩增反应，具体反应条件参考试剂盒说明书。基因表达水平的计算参考K.J.Livak和T.D.Schmittgen[5]文献中的方法。采用384孔板，每个样品测定3个平行。基因相对表达量采用2-△△CT法分析，内参基因选用GADPH。以6 mm的小麦粉碎粒度为对照组，引物设计使用primer3.0软件，测定肉鸡空肠黏膜紧密连接基因：Occludin、ZO-1、Claudin1 mRNA的相对表达丰度。基因引物序列如表2所示。

1.6 数据处理与统计

采用SPSS21.0对数据进行单因素方差分析（one-way ANOVA）及线性（linear）、二次（quadratic）分析，差异显著者采用LSD法多重比较。分析结果用平均值与SEM表示，P＜0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 小麦粉碎粒度

锤片粉碎机分别用孔径为 2、4、6、8、10 mm 的筛片进行粉碎，对应筛片粉碎小麦实测几何平均粒度分别为：460、580、760、880、1 100 μm；具体粒度分布见图1。

2.2 小麦粉碎粒度对肉鸡生产性能的影响

从表3可知，小麦粉碎粒度对肉鸡1～21 d、22～42 d和1～42 d平均阶段增重（BWG）和平均阶段采食量（FI）均无显著影响（P＞0.05）；当小麦粉碎粒度大于8和10 mm时，肉鸡的料重比显著高于其他处理组（P＜0.05），而 2、4、6 mm 粉碎粒度组料重比差异不显著（P＞0.05）。

图1 5种不同孔径筛片粉碎的小麦粒度分布Figure 1 Particle size distribution of wheat with five different screen size

表2 目的基因和内参的引物序列Table 2 The primer sequences of target genes and house-keeping gene

表3 小麦粉碎粒度对肉鸡生产性能的影响Table 3 Effects of wheat grinding particle size on performance of broilers

2.3 小麦粉碎粒度对肉鸡养分利用率的影响

从表4可知，小麦粉碎粒度对肉鸡21 d和42 d养分利用率和AME均没有显著影响（P＞0.05）。但从数值上可以看到，随着小麦粉碎粒度的增加，粗蛋白质的表观利用率呈增加趋势，而干物质的表观利用率和AME却呈降低趋势。

表4 小麦粉碎粒度对肉鸡养分利用率和AME的影响Table 4 Effects of wheat grinding particle size on nutrient utilization and AME of broilers %

2.4 小麦粉碎粒度对肉鸡器官发育的影响

从表5可以看出，21 d时，肉鸡肌胃指数随着小麦粉碎粒度的增加而增加，当小麦粉碎粒度为10 mm时，肌胃指数显著高于 2、4 mm 组（P＜0.05），且呈显著的线性相关；42 d时，小麦粒度为6 mm组肝脏指数显著高于 2、4 mm 组（P＜0.05），与 8、10 mm 组差异不显著（P＞0.05），呈现出显著的线性相关。其余各指标各处理组间差异不显著（P＞0.05）。

2.5 小麦粉碎粒度对肉鸡空肠形态的影响

从表6中可以看出，小麦粉碎粒度对肉鸡21 d和42 d的空肠肠道形态存在显著的影响（P＜0.05）。21 d时，随着小麦粉碎粒度的增加，绒毛高度、黏膜厚度和绒隐比显著增加（P＜0.05），且呈显著的线性相关；42 d时，10 mm 组绒毛高度显著增加（P＜0.05），而6 mm组隐窝深度显著降低（P＜0.05），6 mm组绒隐比显著高于10 mm组（P＜0.05）。

表5 小麦粉碎粒度对肉鸡消化器官指数的影响Table 5 Effects of wheat grinding particle size on digestive organ index of broilers μm

表6 小麦粉碎粒度对肉鸡空肠肠道形态的影响Table 6 Effects of wheat grinding particle size on jejunum morphology of broilers

2.6 小麦粉碎粒度对肉鸡空肠杯状细胞光密度值的影响

从表7可以看出，随着小麦粉碎粒度的增加，肉鸡空肠杯状细胞光密度值显著增加（P＜0.05）。21 d时，4、6、8 mm 组显著高于 2 和 10 mm 组（P＜0.05），呈显著的二次曲线关系；而42 d时，8、10 mm组杯状细胞光密度值显著高于2、4 mm组（P＜0.05），与6 mm组差异不显著（P＞0.05），呈显著的线性相关。

2.7 小麦粉碎粒度对肉鸡空肠黏膜紧密连接蛋白基因表达的影响

由表8可知，随着小麦粉碎粒度的增加，21 d时，肉鸡空肠黏膜ZO-1，occludin和claudin1的mRNA表达量也相应提高，且10 mm组claudin1的mRNA表达量显著高于2 mm组（P＜0.05），呈线性增加（P＜0.05）；但 42 d时，各组间没有显著差异（P＞0.05），从数值上看，其表达量有一定的降低。

表7 小麦粉碎粒度对肉鸡空肠杯状细胞光密度值的影响Table 7 Effects of wheat grinding particle size on the OD of jejunum goblet cell of broilers

表8 小麦粉碎粒度对肉鸡空肠黏膜紧密连接mRNA相对表达量的影响Table 8 Effects of wheat grinding particle size on the relative expression of TJ mRNA of broilers

3 讨论

3.1 小麦粉碎粒度对肉鸡生产性能和养分利用率的影响

本试验结果表明，在粉状饲粮中，小麦粉碎粒度为 460、580、760、880、1 100 μm 时，对肉鸡 BWG和FI均无显著影响。S.Naderinejad等研究表明，粉料中，玉米粉碎粒度对肉鸡FI，BWG和F/G没有显著影响[6]。C.Jacobs等研究了4个玉米粉碎粒度（GMD 557、858、1210和1387μm），结果发现粉料中玉米粉碎粒度对肉鸡生产性能没有显著影响[7]。孟艳莉等研究表明，在蛋雏鸡饲粮中小麦粉碎粒度为2、4和6 mm时，对蛋雏鸡的体重、采食量、日增重、料重比等生产性能指标均无显著影响[8]。S.Yasar使用过4、5、6、7 mm筛的小麦及整粒小麦，结果发现，7 mm小麦组肉鸡21 d生产性能最佳，而4 mm小麦组最差，42 d时，各组间生产性能无显著差异[9]。本试验结果与前人的研究结果基本一致。但也有不一致的报道，I.Nir等发现大粒度饲喂时有较高的FI和BWG（粒度为 897、996 μm 和 1 332 μm）[10-11]。本试验中还发现，当小麦粉碎粒度为880、1 100 μm时，肉鸡的F/G显著增加，且F/G随粉碎粒度的增大有线性递增和二次曲线关系，这和Xu Y.等的研究一致，Xu Y.等报道，粉料中 6 个粉碎粒度（420，430，470，509，542和640 μm），F/G随粉碎粒度的增大呈线性递增[12]。然而A.M.Amerah等得到相反结果，即粗粉碎相对中等粉碎组的F/G低[13]。导致原料粉碎粒度对生产性能研究结果不一致的原因可能与试验动物日龄，不同试验设定的原料几何平均粒度以及不同谷物的特性有关。

通常情况下，与粗粒度饲粮相比，细粉碎饲粮与消化酶的接触面积更大，更有利于营养物质的消化。但家禽由于有肌胃的存在，粗颗粒日粮通过肌胃的速率降低。延长了消化酶与食糜的作用时间[14]，增加酶在食糜中的渗透性[15]，从而提高能量和其他营养物质的利用率。本试验结果表明，小麦粉碎粒度对肉鸡养分利用率和AME均没有显著影响，随着小麦粉碎粒度的增加，粗蛋白质的表观利用率呈先增加后降低的趋势。这与孟艳莉等的研究结果基本一致，孟艳莉等发现中等粒度组（4 mm）的蛋白质消化率显著高于细粒度组（2 mm）和粗粒度组（6 mm）[8]。说明粗粉碎粒度小麦有利于粗蛋白质的消化，但不是越粗越好。

3.2 小麦粉碎粒度对肉鸡消化器官指数和空肠形态的影响

本试验结果表明，肉鸡饲喂粉料时，肌胃指数随小麦粉碎粒度的增大而增大，这与前人的研究一致[14]。对家禽而言，肌胃能够对饲料进行充分的研磨，使粗颗粒饲料选择性地留在肌胃中直到被研磨到某一允许的尺寸后再进入后段消化道，以利于后段消化道的消化吸收。而对于细颗粒饲料，肌胃的研磨作用较少，能够较快地通过肌胃进入后段消化道。所以粗粉碎对于维持肉鸡肌胃健康具有重要作用。

空肠是营养物质吸收的重要部位，其发育状况直接影响营养代谢和生长性能。本试验结果表明，小麦粉碎粒度对肉鸡空肠肠道形态存在显著的影响。21 d时，随着小麦粉碎粒度的增加，绒毛高度、黏膜厚度和绒隐比（V/C）显著增加，且呈显著的线性相关；42 d时，10 mm组绒毛高度显著增加，而6 mm组隐窝深度显著降低，6 mm组绒隐比显著高于10 mm组。张春兰等在蛋鸡上的研究发现，十二指肠绒毛高度、V/C值和肠黏膜厚度随玉米粒度的增加而增加，隐窝深度降低[16]。田玉民等发现，饲喂粗粉碎粒度的肉鸡空肠绒毛显著较高[17]。这与本试验结果一致。可能是由于粒度大的饲粮在消化道中流通时间较长，对肠绒毛及肠腺的刺激作用导致的。也可能与肠道微生物的变化有关，有研究表明，日粮的粉碎粒度对胃肠道微生物的发酵有影响，D.G.Valencia等研究发现，饲料粉碎越细，与消化道内微生物的接触面积越大，对有害微生物的生长越有利[18]。在肉仔鸡上的研究也发现，饲喂粗颗粒粉状日粮，盲肠和直肠内的乳酸菌群数量增加，而细颗粒时乳酸菌数量最少[19]。肠道中有害微生物的增加会破坏肠道结构的黏膜层导致肠绒毛受损，进而导致肠道形态的变化。但也有不一致的报道，I.Rohe等研究发现，细粉碎组的绒毛均高于粗粉碎[20]；A.M.Amerah等报道，玉米和小麦粉碎粒度对肉鸡的十二指肠绒毛高度、隐窝深度及上皮黏膜厚率均无显著性影响[13]。造成这种不一致的结果可能与试验阶段、饲粮类型、实际粉碎粒度和消化道部位有关。

3.3 小麦粉碎粒度对肉鸡空肠杯状细胞和紧密连接蛋白基因表达的影响

杯状细胞分泌黏液黏附于上皮表面，有润滑和保护肠道的作用。杯状细胞的增多能更好地保护小肠黏膜，维持上皮细胞的完整性[21-22]。本试验中，随着小麦粉碎粒度的增加，肉鸡空肠杯状细胞光密度值显著增加，且呈显著的二次曲线关系。说明小麦粉碎粒度能促进空肠黏膜杯状细胞数量的增加，但不是粒度越大越好。而关于粉碎粒度对杯状细胞的影响研究未见报道。分析饲料粉碎粒度导致杯状细胞数量变化的原因可能与粉碎粒度对肠道微生物的影响有关，当饲料粉碎粒度较细时，引起肠道有害微生物数量的增加导致肠道黏膜损伤，而肠黏膜损伤时杯状细胞伴随绒毛脱落而丢失，导致杯状细胞数量的下降[23]。

肠道四大屏障中，机械屏障是肠黏膜屏障中最重要的一环。由上皮细胞和它们之间的连接组成，细胞间连接生物在外环境的稳定性中发挥重要作用，而紧密连接（TJ）是细胞连接最重要的组成成分。紧密连接蛋白的基因表达量是衡量肠上皮屏障功能的重要指标。Zhao J.等发现Occludin和Claudin能够通过影响TJ通透性维持来调节肠道物理屏障功能[24]。本试验研究表明，21 d肉鸡空肠ZO-1、occludin和claudin1 mRNA相对表达量均随小麦粉碎粒度的增大呈线性递增。42 d，ZO-1、occludin和claudin1相对表达量均随粉碎粒度的增大呈线性递减。说明在1～21 d增大粉碎粒度有利于维持空肠黏膜机械屏障的完整性，利于肠道健康，但不是越大越好。关于饲料粉碎粒度对肠道紧密连接蛋白基因表达的研究未见报道。有研究表明，肠道上皮细胞紧密连接蛋白的基因表达量与肠道细菌的代谢产物有关[25]。有害微生物黏附于肠道上皮细胞，会引起肠黏膜功能紊乱，TJ屏障被破坏[26]。饲料粉碎粒度可能通过影响肠道微生物进而影响肠道黏膜紧密连接蛋白的基因表达，但其具体作用机理还需进一步研究。至于21 d和42 d紧密连接mRNA相对表达量随小麦粉碎粒度的增大呈现不同的变化趋势的原因也有待进一步研究。

4 结论

①在粉状饲粮中，小麦粉碎粒度对肉鸡增重和采食量没有显著影响，但随小麦粉碎粒度的增加，料重比显著增加，以中细粉碎较为适宜。

②小麦粉碎粒度增加，可促进肌胃发育和空肠形态改善；增加空肠杯状细胞数量和空肠黏膜claudin mRNA的表达，以中粗粉碎效果更好。

综上所述，肉鸡粉状饲粮中，小麦通过6 mm筛片粉碎时较适宜。

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