菊花脑花活性成分提取工艺及挥发油成分分析

贾小丽，董艺凝，师海荣，余文文，李裕娇，王 婷

（滁州学院 生物与食品工程学院，安徽 滁州 239000）

菊花脑通常被称作为黄菊仔、黄花叶.菊花脑的原产地是中国，菊花脑中含有丰富的的营养物质、适应性强、易栽培等等众多的优良特点，在安徽、江苏等地作为蔬菜广泛种植.目前我国种植较多的板叶菊花脑，还有一小部分地区种植的小叶菊花脑[1-2].菊花脑主要有两部分组成：一部分菊花脑的茎叶，另一部分为菊花脑花.菊花脑的茎叶含有较多的活性成分因此其可以作为蔬菜日常食用也可以作为药材使用.也是因为菊花脑花里含有很多的挥发油，所以和菊花茶一样可以做为日常茶品食用[3-4].菊花脑的茎叶可以炒、拌、煮汤、馅料等.科学家对菊花脑的茎叶进行了研究，发现茎叶中脂肪、纤维素、蛋白质、矿物质的含量较高，另外还含有大量的活性物质：挥发油、黄酮、酚类、菊甙.所以经常食用菊花脑花茎叶不但可以平肝明目、清热解毒、降血压，还可以防治上火、皮肤病、流感等疾病[5-6].菊花脑花也和其他菊花一样，含有大量的活性物质：挥发油、黄酮、酚类物质等[7].官艳丽等人对黄山地区菊花脑花挥发油进行了提取分析，鉴定出了出了66种组分，其中含量较多的红没药醇氧化物和β-檀香醇可能是其消炎、抗菌的主要成分，与此同时还发现不同地区菊花脑花中的挥发油在组成上的有着很大的差别的，可能是菊花脑花生长环境不同导致的[8].有人对南京产菊花脑花中酚类物质进行了提取研究，发现其具有很强的抗氧化性，可以在此方面进行开发和利用[9].

目前，国内外从植物体中提取活性成分的方法主要有常规水提法、蒸馏法、联合提取、超声波辅助提取法、亚临界水提取、超临界流体萃取等[10-11].李大伟[12]采用超声波提取法对迷迭香叶中活性成分进行提取分析，实验确定了最佳的提取剂浓度、超声频率、超声时间、料液比；何小珍[13]等人使用最常使用的蒸气蒸馏法对野菊花挥发油进行提取并且采用气质联用技术对挥发油的成分分离鉴定，一共鉴定出66个组分，占总量的77.32%；赵永敢[14]采用微波辅助提取法确定了提取菊花脑中多酚物质得最佳工艺.然而安徽滁州地区的菊花脑花鲜有关注，本次研究采用常规水提法和超声波辅助提取法对滁州本地的菊花脑花中的黄酮和总酚进行提取并将两种方法进行对比分析；然后通过气质联用对水蒸气蒸馏法所得菊花脑花挥发油进行成分分析；对开发和利用本地菊花脑资源有积极意义.

1 实验材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 原材料

材料：新鲜的菊花脑花（从滁州附近农村采摘）

前处理：将新鲜的菊花脑花洗净、40℃烘干、粉粹、过30目筛得菊花脑花粉末，备用.

1.1.2 实验试剂

芦丁标准品、没食子酸标准品；去离子水、硝酸铝、亚硝酸钠、氢氧化钠、福林酚、碳酸钠、95%乙醇、无水乙醇、无水硫酸铵、正己烷，实验中所用到的试剂均为分析纯，高纯氦气.

1.1.3 实验仪器与设备

DHG-9101-OSA型电热恒温鼓风干燥箱（上海市三发科学仪器有限责任公司）、L3S型可见分光光度计（上海仪电分析仪器有限公司）、QP2010Ultra色谱-质谱联用仪（日本岛津公司）、UWave-1000微波紫外超声三位一体合成萃取反应仪器（上海新仪微波化学科技有限公司）等.

1.2 实验方法

1.2.1 常规水提法的工艺流程

准确称取预处理后的菊花脑花粉末2g与去离子水按照不同比例混合后，置于100mL的烧杯中，将粉末和水摇匀混合后放入恒温水槽中.处理一段时间后将其取出冷却、过滤，最后用提取剂定容到100mL.

1.2.2 超声波辅助提取法的工艺流程

准确称取预处理后的菊花脑花粉末2g与不同浓度得乙醇按照不同比例混合后，置于100mL的烧杯中，将粉末与不同浓度得乙醇溶液摇匀混合后放入超声波提取器.超声波处理一段时间后将其取出冷却，过滤、定容到100mL.

1.2.3 菊花脑花黄酮的测定

亚硝酸钠—硝酸铝—氢氧化钠比色法

1.2.4 菊花脑花总酚的测定

福林酚法

1.2.5 常规水提法工艺条件优化

常规水提法：首先选取水浴温度、料液比、提取时间这三个因素来进行单因素实验，研究各个单因素对菊花脑花提取液里黄酮和总酚得率的影响，初步确定出一个最佳提取条件.然后以提取液黄酮和总酚得率作为实验指标，选用L9(33)正交表进行正交实验，最终可以得到提取菊花脑花黄酮和总酚最优的提取条件.

（1）单因素实验

①水浴温度对菊花脑花黄酮和总酚得率的影响

准确称取5份2.00g菊花脑花粉末，在样品中分别加入70mL的去离子水，把5个样品依次放入水浴温度分别为 50℃、60℃、70℃、80℃、90℃中处理80min后，将样品取出冷却、过滤，最后使用提取剂将滤液定容到100mL.取原液稀释到适当的倍数后，按照1.2.3和1.2.4测定黄酮和总酚得率.每个实验重复三次.

②料液比对菊花脑花黄酮和总酚得率的影响

准确称取5份2.00g菊花脑花粉末，在5个样品中分别加入 50mL、60mL、70mL、80mL、90mL 的去离子水，于70℃下提取80min后，将样品取出冷却、过滤，最后使用提取剂将滤液定容到100mL.取原液稀释到适当的倍数后，按照1.2.3和1.2.4测定黄酮和总酚得率.每个实验重复三次.

③提取时间对菊花脑花黄酮和总酚得率的影响

准确称取5份2.00g菊花脑花粉末，在5个样品中分别加入70ml的去离子水，在70℃的水浴里处理 40min、60min、80min、100min、120min 后，将样品取出冷却、过滤，最后使用提取剂将滤液定容到100mL.取原液稀释到适当的倍数后，按照1.2.3和

1.2.4测定黄酮和总酚得率.每个实验重复三次.

（2）正交实验

通过选取水浴温度、料液比、提取时间这三个因素，然后在分别设置三个实验水平，采用L9（33）正交表进行正交实验，以筛选出一个最优的提取条件.

1.2.6 超声波辅助提取法工艺条件优化

超声波辅助提取法：选取提取剂浓度、料液比、超声时间、超声功率来进行单因素实验，研究各个单因素对菊花脑花提取液里黄酮和总酚得率的影响，初步确定出一个最佳提取条件.然后以提取液中黄酮和总酚得率作为考察指标，后续实验选用L9(34)正交表来进行，最终可以得到提取菊花脑花黄酮和总酚最优的提取条件[15-16].

（1）单因素实验

①提取剂浓度对菊花脑花黄酮和总酚得率的影响

准确称取5份2.00g菊花脑花粉末，在5个样品中按序加入浓度分别为40%、50%、60%、70%、80%的乙醇60mL.各样品依次在300W的超声功率下处理30min后，将样品取出冷却、过滤，最后使用提取剂将滤液定容到100mL.取原液稀释到适当的倍数后，按照1.2.3和1.2.4测定黄酮和总酚得率.每个实验重复三次.

②料液比对菊花脑花黄酮和总酚得率的影响

准确称取5份2.00g菊花脑花粉末，在样品中依次加入 70%的乙醇溶液 40mL、50mL、60mL、70mL、80mL.各样品按依次在300W的超声功率下处理30min后，将样品取出冷却、过滤，最后使用提取剂将滤液定容到100mL.取原液稀释到适当的倍数后，按照1.2.3和1.2.4测定黄酮和总酚得率.每个实验重复三次.

③超声时间对菊花脑花黄酮和总酚得率的影响

准确称取5份2.00g菊花脑花粉末，在样品中分别加入70%的乙醇溶液60mL.各样品依次在300W 功 率 下 处 理 10min、20min、30min、40min、50min后，将样品取出冷却、过滤、定容到100mL.取原液稀释到适当的倍数后，按照1.2.3和1.2.4测定黄酮和总酚得率.每个实验重复三次.

④超声功率对菊花脑花黄酮和总酚得率的影响

准确称取5份2.00g菊花脑花粉末，在样品中分别加入70%的乙醇溶液60mL.各样品依次在100W、200W、300W、400W、500W 的实验条件下处理30min后，将样品取出冷却、过滤、定容到100mL.取原液稀释到适当的倍数后，按照1.2.3和1.2.4测定黄酮和总酚得率.每个实验重复三次.

（2）正交实验

以实验中黄酮和总酚的得率作为实验指标，通过选取提取剂浓度、料液比、超声功率、超声时间这四个因素，然后在分别设置三个实验水平，使用L9（34）正交表进行正交实验，以筛选出一个最优的提取条件.

1.2.7 菊花脑花挥发油成分分析

（1）挥发油的提取

准取称取干燥的菊花脑花30g置于精油快速提取器内，倒入1000mL水.出油口处放置一个装有正己烷的烧杯，通过水蒸气蒸馏法处理3h.得到混合液后分离出正己烷，加入适量的无水硫酸钠对溶液进行脱水处理后.使用旋转蒸发器将溶液浓缩到10mL，取样进行气质联用分析，最后采用NIST14谱库进行鉴定.

（2）GC-MS条件

气相色谱：色谱柱 RTX-5MS（30mm×0.25mm×0.25μm）；升温程序：开始温度为60℃，保持4min.以4℃/min升至130℃，保留5min.再以6℃/min升至280℃，保留5min.进样口温度：250℃；载气为高纯氦气，流速为1mL/min；进样量1μL；分流比：14：1.

质谱条件：电离方式EI，电子能70ev，四级杆温度160℃，扫描范围：40-500amu.

2 结果与分析

2.1 常规水提法的单因素实验结果分析

2.1.1 水浴温度对黄酮和总酚得率的影响

图1 水浴温度对黄酮和总酚得率的影响

由图1可知，在水浴温度上升的同时黄酮和总酚的得率也在上升，在温度为80℃时达到最高；随后在增加温度时候，二者得率略有降低.温度升高使得菊花脑花细胞壁发生破裂，细胞内的物质加速流出；当温度过高时会促使黄酮和总酚发生氧化，从而使得二者提取率降低.因此确定温度80℃最为适宜.

2.1.2 料液比对黄酮和总酚得率的影响

图2 料液比对黄酮和总酚得率的影响

由图2可知，当料液比升至1：35的时候提取液黄酮和总酚得率最高，继续增加料液比二者得率逐渐减小.原因分析是逐渐增加料液比的时候，使细胞内外的浓度差变大，加快细胞内的物质流出，在料液比1：35流出速率最快.随后继续增加料液比时，就相当于对整个体系进行了稀释，使得物质的流出速率降低，因而造成提取率下降.从实验结果最终确定料液比1：35最佳.

2.1.3 提取时间对黄酮和总酚得率的影响

由图3可知，当提取时间为80min的时候提取液中的黄酮和总酚的得率达到最大，再延长时间二者的得率就呈现下降趋势.原因分析是长时间加热会对破坏细胞内的物质，影响黄酮和酚类物质的稳定性，使之发生氧化、聚合、降解等反应.因此确定80min最适宜时间.

图3 提取时间对黄酮和总酚得率的影响

2.2 常规水提法的正交实验结果分析

以菊花脑花提取液中的黄酮和总酚得率作为考查指标，采用L9(33)正交表来进行实验，因素水平安排见表1，正交实验结果与分析见表2.

表2 常规水提法的正交实验结果分析

通过分析表中的R值可以发现，实验中的三个因素对菊花脑花提取液中的黄酮和总酚得率影响的主次分别为水浴温度、提取时间、料液比.根据K值，结合黄酮和总酚得率分析得出，最优的提取条件是A2B2C3，选取1：35的料液比，在80℃的水浴下提取100min.最终黄酮的得率为12.41mg/g，总酚的得率为7.58mg/g.

2.3 超声波辅助提取法的单因素实验结果分析

2.3.1 提取剂浓度对黄酮和总酚得率的影响

图4 提取剂浓度对黄酮和总酚得率的影响

由图4可以看出，随着提取剂浓度的不断增加的同时，黄酮和总酚的得率也在增加，在60%达到最高.原因分析是当提取剂浓度较低时，不利于体系中的有效成分溶解和析出；当提取剂浓度过高时，会造成提取剂难以进入细胞内部，从而使二者得率又出现降低的现象.因此确定60%的乙醇溶液作为提取剂最为适宜.

2.3.2 料液比对黄酮和总酚得率的影响

图5 料液比对黄酮和总酚得率的影响

由图5可知：当料液比升至1：30的时候提取液中的黄酮和总酚得率最高，若继续增加料液比二者得率又逐渐减小.分析原因是当料液比相对较低时，单位菊花脑花细胞吸收的能量较高，超声波促使细胞破碎程度较好，从而菊花脑花细胞中的有效成分更易溶出；当料液比相对较高时，单位菊花脑花细胞吸收的能量较低，使细胞破碎不尽完全，从而影响黄酮和总酚的得率.因此确定最适料液比为1：30.

2.3.3 超声时间对黄酮和总酚得率的影响

图6 超声时间对黄酮和总酚得率的影响

由图6可知：当超声时间增加到30min时，提取液中的黄酮和总酚的得率达到最高；再延长时间二者的得率就呈现下降趋势.分析原因是随着时间的增加，菊花脑花细胞被粉碎的几率越大，使得细胞中的物质可以更快的溶出，所以黄酮和总酚得率逐渐升高；但如果超声时间过长会产生很多热量，从而影响菊花脑花中各成分的稳定性，从而使黄酮和总酚得率略有降低.最终确定30min为最适宜超声时间.

2.3.4 超声功率对黄酮和总酚得率的影响

图7 超声功率对黄酮和总酚得率的影响

由图7可知：当超声功率增加至200W的时候提取液中黄酮和总酚得率最高，继续增大超声功率时二者得率逐渐减小.分析原因是随着超声功率的增加，超声的空化强度亦增强，分子扩散就越剧烈，所以黄酮和总酚得率逐渐上升；但当超声功率增大到一定值后，空化趋于饱和，就会产生大量无用气泡，从而降低空化强度，从而使黄酮和总酚得率降低.因此确定超声功率200W最为适宜.

2.4 超声波辅助提取法的正交实验结果分析

以菊花脑花提取液中黄酮和总酚得率作为考查的指标，选用L9(34)正交表来进行实验，因素水平安排见表3，正交实验结果与分析见表4.

表3 正交实验因素水平表

表4 超声波辅助提取法的正交实验结果分析

通过分析表中R值可以得知，实验中的四个因素对菊花脑花提取液中的黄酮和总酚得率影响主次依次是提取剂浓度、料液比、超声功率、超声时间.根据K值可以分析得出，提取黄酮最优工艺参数为A2B3C1D2，提取总酚最优工艺参数为A2B3C3D2；菊花脑花黄酮和总酚最优组合仅在超声时间上存在差异.再结合黄酮和总酚得率，可知最优组合是A2B3C1D2；另外，由于超声时间对实验影响较低，综合生产成本和能耗上考虑，最终选取A2B3C1D2为最优工艺参数，即料液比为1：35加入60%浓度的提取剂，在200W的超声功率下处理20min；此时提取液中的黄酮得率为20.34mg/g、总酚得率为7.97mg/g.

2.5 菊花脑花挥发油成分分析

图8 菊花脑花挥发油成分测定色谱图

表5 菊花脑花挥发油的化学成分

组号 保留时间/min 化合物名称 分子式 相对分子质量 相对百分含量/%41 17.670 红没药醇 C15H26O 222 0.80 42 17.745 檀香醇 C15H24O 220 5.87 43 17.815 棕榈酸甲酯 C17H34O2 270 1.20 44 18.615 邻苯二甲酸二异丁酯 C16H22O4 278 2.03 45 19.575 左旋乙酸冰片酯 C12H20O2 196 4.83 46 33.600 十氢二甲基甲乙烯基萘酚 C15H26O 222 0.89 47 48.440 邻苯二甲酸二酯 C24H38O4 390 1.51 48 50.590 正三十四烷 C34O70 478 0.78 49 53.105 正三十六烷 C36H74 506 1.88 50 54.645 香树脂醇 C30H50O 426 3.41

经过GC-MS分析，从送检的样品中一共检出50种挥发性成分（见表5），其中含量较高的有樟脑（9.92%）、β-倍半水芹烯 （7.75%）、石竹烯（5.98%）、檀香醇（5.87%）.色谱图见图8.

3 结论

本文采用单因素和正交实验对两种不同的方法提取菊花脑花黄酮和总酚的工艺进行优化，以黄酮和总酚的得率为指标，获得的优化工艺条件：①常规水提法将粉粹的菊花脑花按照1：35料液比添加去离子水，混合均匀后在80℃的水中提取100min，黄酮和总酚的得率分别为12.41mg/g和7.58mg/g.②超声波辅助提取法将粉碎的菊花脑花按照1：35的料液比添加60%的乙醇，混合均匀后在200W的功率下超声20min，黄酮和总酚的得率分别为20.34mg/g和7.97mg/g.超声波辅助提取法对黄酮物质的提取率明显高于常规水提法，而对总酚的提取率无较大影响.

使用气质联用技术对菊花脑花中的挥发油成分进行分析，共鉴定出大概50种物质，其中含量较高的有樟脑（9.92%）、β-倍半水芹烯（7.75%）、石竹烯（5.98%）、檀香醇（5.87%）.

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