两种酿酒酵母混合发酵对赤霞珠干红葡萄酒香气成分的影响

于亚敏,李 霞,唐国冬,杨继红,2,3*

(1.西北农林科技大学 葡萄酒学院,陕西 杨凌 712100；2.陕西省葡萄与葡萄酒工程技术研究中心,陕西 杨凌 712100；3.西北农林科技大学 合阳葡萄示范站,陕西 合阳 715300)

酿酒酵母由于发酵力强,酒精转化率高,耐受高浓度的糖、乙醇、SO2等,而在酒精发酵过程中占据主导地位［1-2］。酿酒酵母是影响葡萄酒的香气最重要的因素之一［3］。研究表明,酿酒酵母产生的次级代谢产物能够影响葡萄酒风味［4］,且不同的菌株会有不同的影响［5］。李景明等［6-7］研究发现,不同酿酒酵母单独发酵的赤霞珠葡萄酒的主要香气成分相同,但含量有显著差异。

单一的商业酿酒酵母发酵使得葡萄酒的风格和潜力趋于同质化,为了使葡萄酒风格的多样化,科研工作者尝试非酿酒酵母和酿酒酵母混合发酵的研究［8-9］,而关于酿酒酵母混合发酵的研究报道较少。HOWELL K S等［10］通过代谢足迹法研究发现混合发酵的成品酒的香气轮廓有别于单种酿酒酵母分别发酵后混合调配的葡萄酒香气轮廓。SABERIS等［11］研究发现两种勃艮第本土酿酒酵母混合发酵的霞多丽葡萄酒具有浓郁的甜果、草莓、青苹果、梨和香蕉香气,比其他6种商业酿酒酵母单独酿制成品酒的香气更为独特和复杂。

酿酒酵母F15酿制的赤霞珠干红葡萄酒香气丰富,具有果香、油脂香、草香、酒香、花香,但花香、果香不突出［6,12］。酿酒酵母EC1118最初从香槟酒中分离得来,被广泛应用于干白葡萄酒、起泡葡萄酒、苹果酒以及甜酒的酿制,具有花香、果香味浓郁的香气特征［13］。本研究以酿酒酵母F15单独发酵为对照,通过添加不同比例的酿酒酵母EC1118和F15混合发酵赤霞珠干红葡萄酒,探讨酿酒酵母EC1118与F15混合发酵对赤霞珠干红葡萄酒香气成分的影响,以期为混合酿酒酵母发酵的开发和利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

葡萄原料：红色酿酒品种赤霞珠,2015年10月采自陕西泾阳产区。原料糖度为210 g/kg(以葡萄糖计),酸度为7.90 g/kg(以酒石酸计)。

酿酒酵母EC1118：法国LALVIN公司；酿酒酵母F15：法国LAFFORT公司。

葡萄糖、无水乙酸钠、氢氧化钠、邻苯二甲酸氢钾、五水合硫酸铜、酒石酸钾钠(均为分析纯)：广东光华科技股份有限公司；亚硫酸溶液(含6%SO2)：陕西省矿物化工所；果胶酶(酶活4 400 U/g)、澄清剂(鱼胶、交联聚乙烯吡咯烷酮、膨润土按一定比例混合)：法国LAFFORT公司。

1.2 仪器与设备

TraceDSQ气质联用(gaschromatograph-massspectrometer,GC-MS)仪：美国Thermo Finnigan公司；TurboMatrix 350热解析仪：美国PerkinElmer公司；DB-Wax色谱柱(30 m×0.25mm×0.25μm)、UV-60紫外可见光分光光度计：美国安捷伦公司；聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane,PDMS)涂层覆盖的搅拌棒(Twister)(10 mm×0.5 mm)：德国Gerstel公司；5804R台式冷冻离心机：德国Eppendorf公司；XC-310 4℃医用冷藏箱：澳柯玛医疗器械有限公司；GC-17蒸馏装置：郑州中天实验仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 赤霞珠干红葡萄酒的酿造

酿造工艺［14］：取成熟度良好、果粒完整的赤霞珠葡萄共84 kg,等量分装于12个10 L窄口玻璃发酵罐中,手工破碎,破碎度50%,留取适量的上清液测定葡萄汁的糖酸含量。破碎完毕,立即添加亚硫酸溶液,使SO2质量浓度达到50mg/L。试验设计目标酒精度为13%vol,按照17.5g糖转化为1%vol的酒精度进行换算,补加蔗糖调整葡萄汁糖度至227.5 g/L。在添加亚硫酸溶液1 h后添加果胶酶20 mg/L。静置24 h后,以酿酒酵母F15单独发酵为对照,添加不同比例菌株EC1118和F15(1∶9、3∶7和5∶5)的经活化的酵母共200 mg/L,启动发酵,并控制发酵温度为28℃。每天检测3次发酵液的温度、比质量,待比质量降至1.010时分离皮渣并轻微压榨,混合自流汁和压榨汁,继续发酵至比质量降至0.992～0.996并保持2 d恒定后,膨润土下胶,24 h后分离清液,并立即添加亚硫酸溶液,使SO2质量浓度达到50 mg/L,装罐密封置于4℃冷库贮藏3个月后,再装瓶置于4℃冷库贮藏3个月后测定各个指标。

1.3.2 基本理化指标的测定

还原糖和总糖(以葡萄糖计)：采用直接滴定法；总酸(以酒石酸计)和挥发酸(以醋酸计)：采用指示剂法；酒精度和干浸出物：采用密度瓶法。以上检测方法均参照国标GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》［15］中的方法进行。试验均重复3次,结果以平均值±标准偏差表示。

1.3.3 香气成分测定

采用搅拌棒吸附萃取法(stir bar sorptive extraction,SBSE)提取赤霞珠干红葡萄酒的香气成分,具体方法参考李娜娜等［16］的方法。

TurboMatrix 350热解吸仪分析条件：以氦气(He)为载气,脱附流速设为45 mL/min,加热阀温度设为245℃,脱附管温度为270℃,脱附15 min；传输线温度为255℃。冷阱捕集温度设为-30℃,以40℃/min升至255℃(二级解吸冷阱温度)；出口分流比为3∶1,进样He流速为1 mL/min。

GC条件：DB-WAX色谱柱(30 m×0.25mm,0.25μm)以氦气(He)为载气,流速设为1mL/min。升温程序为40℃保持3min,以4℃/min升至160℃,7℃/min至230℃,保持8 min,连接杆温度设为230℃。

MS条件：全扫描范围为33～450 amu,每秒扫描1次。以电子电离(electron ionization,EI)为电离源,离子源温度230℃,电子能量70eV,灯丝流量0.2mA,检测器电压350V。

定性定量：数据图谱经计算机图谱软件XcaLibur系统分析与美国国家标准技术研究所(national instituteof standardsand technology,NIST)2005标准谱库NIST Chemistry(http：//webbook.nist.gov/chemistry)相匹配,结合标准物质保留指数定性。以2-辛醇为内标物(质量浓度1 170μg/L),采用内加标准法定量计算各成分含量［6］,即检出成分峰面积与内标物峰面积的比值,乘校正因子和内标物质量浓度,对于无标准物质的挥发性成分,计算时,采用与其化学结构相似物质的校正因子。

1.3.4 数据处理

试验数据采用Excel 2010进行计算,用SPSS 19.0软件进行方差分析(analysis of variance,ANOVA),多重比较(multiplecomparison,MC)和主成分分析(principal componentanalysis,PCA)。

2 结果与分析

2.1 酿酒酵母混合发酵对赤霞珠干红葡萄酒理化指标的影响

由表1可知,4组不同比例混合酵母所酿的葡萄酒的还原糖含量均＜2 g/L,发酵彻底,挥发酸含量均＜0.4 g/L,没有发生破败,总酸含量均在6.50 g/L左右,性质稳定；混合组的还原糖含量显著低于对照组(P＜0.05),说明酿酒酵母混合发酵提高了葡萄汁中还原糖的利用率。各组的酒精度在13.10%vol～11.50%vol之间,其中菌株EC1118和F15比例为1∶9和3∶7组所酿葡萄酒的酒精度显著高于对照组和5∶5组(P＜0.05),说明适宜比例的混合酿酒酵母发酵能够提高酒精的转化率,这与酵母EC1118有较强葡萄糖和果糖利用能力以及酒精生成能力的文献报道相一致［13］。5∶5组所酿葡萄酒的还原糖、总糖含量和酒精度均较低,而干浸出物含量显著的高于1∶9和3∶7组的,与对照组的差异不显著。酿酒酵母EC1118和F15混合发酵的赤霞珠干红葡萄酒基本理化指标结果均符合国家标准GB/T 15037—2006《葡萄酒》［17］,且比例为1∶9和3∶7时,酒精度显著增高(P＜0.05)。

表1 混合酿酒酵母发酵酿制的赤霞珠干红葡萄酒的理化指标Table 1 Physical and chemical indicators of Cabernet Sauvignon dry red wines produced by mixed fermentation of two kinds of Saccharomyces cerevisiae

2.2 酿酒酵母混合发酵对赤霞珠干红葡萄酒香气成分的影响

通过GC-MS对4组不同比例混合酵母所酿葡萄酒的香气物质进行定性、定量分析,共得到46种挥发性物质(见表2),包含酯类物质24种,醇类物质7种,酸类物质11种,酮类物质3种,及烯烃类物质1种。对照组和菌株EC1118和F15比例为3∶7组的香气成分种类最多(均为40种),5∶5组的次之(33种),1∶9组的最少(27种)；3∶7组的香气成分总量显著高于其他组(P＜0.05)。在混合发酵过程中,酵母菌间会相互占有或者利用异己菌株分泌的中间代谢产物［10］,这使得本研究中混合组的香气在种类上等于或者少于对照组,而含量上要多于对照组。因此,酿酒酵母EC1118和F15混合发酵会使得成品酒的香气种类减少,含量增加,当两者混合比例为3∶7时,香气含量增加的最多。

表2 酿酒酵母混合发酵酿制的赤霞珠干红葡萄酒的香气成分Table 2 Aroma components of Cabernet Sauvignon dry red wines produced by mixed fermentation of two kinds of Saccharomyces cerevisiae μg/L

续表

酯类是葡萄酒中最重要的香气物质［1,21-22］。由表2可知,对照组的酯类物质种类最多(21种),菌株EC1118与F15比例为3∶7组和5∶5组次之(18种、17种),1∶9组最少(14种)。混合组的酯类物质总量与对照组之间差异不显著。3∶7组的酯类物质总量显著高于1∶9组和5∶5组(P＜0.05)。这与混合酵母发酵过程中,酵母的酯酶活性与接种顺序、酵母的生长状况有关［1］。3∶7组中的辛酸乙酯、正己酸乙酯、庚酸乙酯、己酸异戊酯、乙酸苯乙酯和3-苯丙酸乙酯的含量显著高于其他组(P＜0.05)。

高级醇是酵母通过艾利希途径(Ehrlich Pathway)产生的重要香气物质［23］,＜300 mg/L时赋予葡萄酒复杂感,＞400mg/L时会带来不愉悦的风味［24-25］。由表2可知,混合组的醇类物质总量显著高于对照组(P＜0.05),且含量均＜300mg/L。3∶7组的醇类物质含量显著高于其他组(P＜0.05),其1-壬醇和苯乙醇的含量显著高于其他组(P＜0.05),其金合欢醇含量显著高于对照组和5∶5组(P＜0.05),其具有玫瑰、菩提花香气［19］。

有机酸是保持葡萄酒平衡的主要物质［26-27］。由表2可知,3∶7组的酸类物质总量显著高于其他组(P＜0.05)。3∶7组中壬酸、十一烷酸、月桂酸和油酸的含量较低但显著高于其他组(P＜0.05)。短链、中链脂肪酸通常会给葡萄酒香气带来负面影响,却是合成酯类物质的必不可少的前体物质［28-29］。3∶7组的辛酸含量显著高于对照组(P＜0.05)。1∶9组的肉豆蔻酸的含量显著高于其他组(P＜0.05)。

4组成品酒香气中的酮类含量和种类都较少,且总含量存在显著差异(P＜0.05)。3∶7组的酮类物质含量显著高于其他组(P＜0.05),其大马士酮的含量显著高于其他组(P＜0.05),具有玫瑰花香、榅桲果香。仅在3∶7组中检测到香叶基丙酮,其具有花香。而略有香味的角鲨烯在1∶9组中含量显著高于3∶7组(P＜0.05)。4组香气中,仅检测出3种萜烯类香气物质——香叶醇、大马士酮和香叶基丙酮。

综上所述,酿酒酵母EC1118和F15混合发酵得到赤霞珠干红葡萄酒的酯类、醇类和酸类等香气物质的含量均有所增加。当两者的混合比例为3∶7时,香气的含量显著高于其他组(P＜0.05),果香、花香成分增加的最多。

选取对4组成品酒香气贡献较大的26种香气物质的进行主成分分析,结果见图1。由图1可知,提取出的前两个主成分对整体方差的累计贡献达到86.66%,PC1和PC2的贡献分别为45.54%和42.12%。3∶7组处于在果香和花香香气成分密集的区域,即丁酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、异戊酸乙酯、正己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯等成分分布的PC1与PC2的正半轴区域。5∶5组分布在香气成分较密集的区域,与异戊醇的分布接近,这可能与酵母菌株的BAT1基因的过表达有关［3］。对照组和1∶9组与大多的香气成分的分布较为疏远。1∶9组与香叶醇和肉桂酸乙酯分布较近,对照组与乙酸异戊酯分布较近。由此可知,酿酒酵母EC1118和F15混合发酵对赤霞珠干红葡萄酒中呈果香、花香的挥发类香气物质的影响较大,当两者的混合比例为3：7时,成品酒香气种类最为密集、复杂,果香和花香更为浓郁突出,香气质量最佳。

图1 混合酿酒酵母发酵的赤霞珠干红葡萄酒的香气成分主成分分析Fig.1 Principal component analysis of aroma components of Cabernet Sauvignon dry red wines produced by mixed fermentation of two kinds of Saccharomyces cerevisiae

3 结论

本研究以酵母F15单独发酵为对照,添加不同比例的酿酒酵母EC1118和F15混合发酵得到赤霞珠干红葡萄酒的理化指标均符合国家标准,酯类、醇类和酸类等香气物质的含量均有所增加。当菌株EC1118与F11的混合比例为1∶9和3∶7时,葡萄酒中酒精度显著增高(P＜0.05)；且当二者比例为3∶7时,香气成分总含量显著高于其他组(P＜0.05),果香、花香香气成分聚集。本研究为酿酒酵母混合发酵的开发和利用提供了参考。

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