不同酿酒高粱酚类物质含量测定及抗氧化活性比较

田新惠,唐玉明,任道群,姚万春,刘茂柯,张星宇

(1.四川省农业科学院 水稻高粱研究所生物中心,四川 德阳 618000；2.泸州市酿酒科学研究所,四川 泸州 646100)

高粱是世界五大作物之一［1］,在我国种植面积广泛,主要用于酿酒、酿醋以及工业原料等［2］。高粱是白酒的主要酿造原料,俗话说“好酒离不开红粮”说明原料对白酒品质的重要性［3］。高粱籽粒中富含多酚类化合物、原花青素、黄酮类化合物、单宁酸等具有很强的抗氧化成分［4］。有研究发现,富含多酚的高粱品种酿造的白酒口感绵甜,回味悠长,是优质白酒酿造原料［5-6］。

高粱籽粒中多酚类物质丰富,其含量在不同地区与品种间的差异较大［7-8］。优质白酒多选用四川糯红高粱,结合特殊的酿造工艺进行酿造而成。目前从白酒中已检测出多种对人体有益的功能性成分［9］,包括低分子有机酸、酯类、杂环类等多酚类物质成分,如阿魏酸等具有健康保健功效［10］。酿造原料中的酚酸类物质也是白酒中风味物质形成的前体物质。

目前,对于酿酒高粱的研究,仅限于优良品种的培育,而对酿酒高粱籽粒中多酚类化合物的研究较少。因此,本实验从酿造原料“红粮”入手,以企业推广应用的酿酒高粱为研究对象,研究不同品种酿酒高粱籽粒中游离态与结合态酚类物质的组成及含量,并进行抗氧化活性分析,为筛选优质专用酿造品种提供理论支持,以期为优化酿造工艺以及健康白酒有益成分来源的形成提供前期研究基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

实验所用酿酒高粱品种见表1,2016年收获成熟新籽粒,晒干,4℃保存备用。

没食子酸(纯度≥97.9%)、原儿茶酸(纯度≥98.9%)、龙胆酸(纯度≥99.5%)、咖啡酸(纯度≥99.0%)、香草酸(纯度≥98.2%)、丁香酸(纯度≥98.0%)、香豆酸(纯度≥98.0%)、阿魏酸(纯度≥99.3%)、水溶性维生素E(6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylicacid,Trolox)(纯度≥98.0%)、三吡啶三吖嗪(tripyridyl-triazine,TPTZ)(纯度≥98.0%)、福林酚(色谱纯)：美国Sigma公司；芦丁(纯度≥98%)：索莱宝生物有限公司；无水甲醇、碳酸钠、亚硝酸、过硫酸钾、六水氯化铝、乙酸乙酯(均为分析纯)：恒泰力天生物有限公司。

1.2 仪器与设备

RE-52AA旋转蒸发器：上海亚荣科技有限公司；UltiMate 3000高效液相色谱仪：德国赛默飞公司；U-3010型紫外可见分光光度计：日本Hitachi公司；CT410旋风式样品磨：福斯赛诺分析仪器有限公司；RE-52旋转蒸发器：上海亚荣系列仪器厂。

1.3 试验方法

1.3.1 酿酒高粱籽粒样品的制备

分别称取100 g不同品种的高粱籽粒,粉碎,过80目筛后,于-20℃保存。

1.3.2 酿酒高粱籽粒中水分含量的测定［11］

采用差减法测定水分含量,每个试验重复3次。

1.3.3 酿酒高粱籽粒中游离态酚类物质的提取

参照TIH等［12］的方法稍有改动：称取酿酒高粱籽粒样品1 g,加入15 mL温度为4℃的酸化甲醇(体积分数95%甲醇∶1 mol/LHCl=85∶15,V/V)于4℃条件下振荡提取10 min,3 500×g离心10 min,取上清液,重复提取3次后,合并上清液,于45℃旋转蒸发至无水状态,用体积分数为80%的甲醇溶解并定容至10 mL,于-20℃保存,待测。

1.3.4 酿酒高粱籽粒中结合态酚类物质的提取

参照SHENGER等［13］的方法提取高粱籽粒中结合态酚类物质：向提取游离酚后的沉淀物中,加入20 mL 2 mol/L NaOH,在氮气保护下搅拌1 h后,用HCl(6 mol/L)调节水解液的pH值至1.5～2.0,添加80 mL正己烷振荡除脂类物质,加入40 mL乙酸乙酯,静置15 min,3 000×g离心15 min,重复提取5次后,合并提取液,于45℃旋转蒸发至干,采用体积分数为80%的甲醇溶解并定容至10 mL,于-20℃保存。

1.3.5 酿酒高粱籽粒中总酚含量的测定［14］

样品中总酚含量的测定：以没食子酸(gallic acid,GA)标准品溶液质量浓度(x)为横坐标,吸光度值(y)为纵坐标,绘制标准曲线,得回归方程：y=23.54x+0.043,相关系数R2=0.999 3。按照没食子酸标准曲线回归方程计算样品中总酚的含量,结果以没食子酸当量(gallic acid equivalent,GAE)表示mg GAE/100 g。

1.3.6 酿酒高粱籽粒中总黄酮含量的测定［15］

样品中总黄酮含量的测定：以芦丁标准品溶液质量浓度(x)为横坐标,吸光度值(y)为纵坐标,绘制标准曲线,得回归方程：y=0.003 1x+0.004 4,相关系数R2=0.999 6,依据标准曲线回归方程计算样品中总黄酮的含量,结果以mg/100 g表示。

1.3.7 高效液相色谱法测定酚酸物质的含量［16］

采用高效液相色谱(highperformanceliquid chromatography,HPLC)法测定酿酒高粱籽粒中单体酚酸物质的含量,HPLC检测条件：SB-C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5μm)；检测波长280 nm；柱温为40℃；进样量为10μL；流动相A(2%甲酸)和流动相B(乙腈),梯度洗脱条件：0～30 min,A 95%～75%,B 5%～25%；30～50min,A 60%,B 40%；50～60 min,A 95%,B 5%,后运行5 min,总运行时间65 min；流速为0.80 mL/min。

标准曲线的绘制：将酚类化合物的标准品(没食子酸、原儿茶酸、龙胆酸、咖啡酸、香草酸、丁香酸、香豆酸、阿魏酸)系列溶液,按照高效液相色谱法测定并制定标准曲线,每种酚类化合物的含量测定结果用μg/g表示。

1.3.8 抗氧化活性分析［17-18］

(1)酿酒高粱籽粒样品铁离子还原力测定

根据参考文献稍作相应修改：制备铁离子还原能力(ferric ion reducing antioxidantpower,FRAP)试剂,取20μL高粱籽粒游离酚、结合酚提取液,加入260μL FRAP试剂,充分混匀避光反应20 min,然后在波长593 nm处测定吸光度值。以不同浓度(x)Trolox标准品溶液为横坐标,吸光度值(y)为纵坐标,绘制标准曲线,得回归方程：y=0.002 0x-0.036 1,相关系数R2=0.999 8,按照Trolox的标准曲线回归方程,计算样品的FRAP值,结果以μmol/g表示。

(2)酿酒高粱籽粒样品自由基清除能力测定［18］

2,2‘-连氮-二(3乙基苯并咪唑啉-6磺酸)(2,2‘-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid,ABTS)自由基清除能力测定：用无水甲醇调节ABTS母液的浓度,使其在波长734 nm处的吸光度值为0.70±0.02,将其作为ABTS自由基工作液。4.9mL ABTS自由基工作液与0.1mL高粱籽粒提取液混合,静置,室温条件下反应10 min后立即在波长734 nm处测定吸光度值,以无水甲醇作空白,按照Trolox的标准曲线回归方程,计算样品的ABTS自由基清除能力,采用Trolox当量(Trolox equivalent,TE)表示某种抗氧化剂相当于Trolox的浓度(mmol/L),结果以μmol TE/g表示。

1.3.9 数据分析

采用SPSS16.0、Excel2013软件进行数据分析,重复3次,数值以均值加标准差表示。

2 结果与分析

2.1 不同品种酿酒高粱籽粒的总酚含量

不同品种酿酒高粱籽粒中游离态和结合态总酚含量测定结果见图1。由图1可知,不同品种酿酒高粱籽粒结合态总酚存在显著性差异(P＜0.05),其中,国窖红高粱籽粒结合态总酚含量最高为1 383.08 mg GAE/100 g,内蒙高粱总酚含量最低为618.2 mg GAE/100 g。而游离态总酚含量之间差异较小,其中,泸糯8号来源的高粱籽粒含量最高为274.38 mg GAE/100 g。结合态总酚含量高于游离态总酚含量,表明酿酒高粱籽粒中总酚以结合态为主。

图1 不同品种酿酒高粱籽粒中总酚含量测定结果Fig.1 Determination results of total phenolic contents in different varieties of liquor-making sorghum

2.2 不同酿酒高粱品种的总黄酮含量

不同品种酿酒高粱籽粒游离态和结合态总黄酮含量测定结果如图2所示。由图2可知,不同品种酿酒高粱籽粒中的结合态总黄酮含量均高于游离态总黄酮含量。青壳洋、国窖红、泸糯8号高粱品种的结合态总黄酮含量(434.84mg/100g、303.39mg/100g、267.58mg/100g)明显高于辽宁、山西、内蒙高粱品种(123.06mg/100g、162.90mg/100g、175.48mg/100g),且结合态黄酮含量品种间差异显著(P＜0.05)。不同品种酿酒高粱籽粒间的游离态黄酮含量差异较小,表明酿酒高粱籽粒中的黄酮类物质主要以结合态形式存在。

图2 不同品种酿酒高粱籽粒中总黄酮含量测定结果Fig.2 Determination results of total flavonoids contents in different varieties of liquor-making sorghum

2.3 不同酿酒高粱籽粒中酚酸物质含量

采用高效液相色谱法测定不同酿酒高粱籽粒中游离型与结合型酚酸物质含量。7种混合标准品液相色谱图如图3所示。由于龙胆酸检测波长为320 nm,故而未在混标之内,采用单标测定。

图3 标准混合标样HPLC色谱图Fig.3 HPLC chromatogram of mixed standard sample

不同品种酿酒高粱籽粒中游离态与结合态酚类物质组成及含量测定结果见表2。由表2可知,不同品种酿酒高粱籽粒中的游离态和结合态的酚类物质组成基本相同,但品种间各酚酸物质含量差异显著(P＜0.05)。酿酒高粱籽粒中香豆酸、咖啡酸、香草酸、原儿茶酸、丁香酸、阿魏酸均以游离态与结合态形式存在,而没食子酸仅以游离态形式存在,龙胆酸在检测样品中均未检出。酿酒高粱籽粒中游离态酚酸主要以阿魏酸、丁香酸与没食子酸为主,三者约分别占游离态总酚酸的39.6%、24.6%及23.3%,平均含量分别为611.19μg/g、380.66μg/g、359.34μg/g。结合态酚酸含量主要以阿魏酸、丁香酸为主,其含量分别占结合态总酚酸的72.69%、17.03%,平均含量分别为1 608.33μg/g、376.78μg/g。

表2 不同品种酿酒高粱籽粒中酚酸物质含量测定结果Table 2 Determination results of phenolic acids contents in different varieties of liquor-making sorghum μg/g

2.4 不同品种酿酒高粱籽粒的铁离子还原能力

不同品种酿酒高粱籽粒的游离态与结合态物质的铁离子还原能力如表3所示。由表3可知,酿酒高粱籽粒中游离态铁离子还原能力值在5.92～7.46μmol/g范围内。结合态抗氧化能力值在29.37～55.34μmol/g范围内,且结合态多酚的抗氧化能力为游离态的抗氧化能力的5～8倍,其中结合态抗氧化能力占总抗氧化能力的85.7%。6种酿酒高粱品种的总抗氧化能力顺序依次为泸糯8号＞青壳洋＞国窖红＞内蒙高粱＞山西高粱＞辽宁高粱,四川酿酒高粱籽粒中总抗氧化能力高于其他地区酿酒高粱籽粒。

表3 不同酿酒高粱品种的FRAP值Table 3 FRAP value of different varieties of liquor-making sorghum

2.5 不同品种酿酒高粱籽粒的ABTS自由基清除能力

不同品种酿酒高粱籽粒的游离态与结合态物质的ABTS自由基清除能力如表4所示。由表4可知,酿酒高粱籽粒中游离态ABTS自由基清除能力在5.49～7.43μmol TE/g范围内；结合态ABTS自由基清除能力在30.79～47.84μmol TE/g范围内。结合态为游离态ABTS自由基清除能力的6倍,品种间差异显著(P＜0.05)。酿酒高粱籽粒结合态ABTS自由基清除能力占总ABTS自由基清除能力的85.4%。6种酿酒高粱品种ABTS自由基清除能力顺序依次为泸糯8号＞青壳洋＞国窖红＞内蒙高粱＞山西高粱＞辽宁高粱,且四川酿酒高粱籽粒中抗氧化能力高于其他地区酿酒高粱品种。

表4 不同酿酒高粱品种的ABTS自由基清除Table 4 ABTS free radical scavenging of different varieties of liquor-making sorghum

3 结论

(1)六种酿酒高粱籽粒中总酚、总黄酮以及8种酚酸总和的含量范围分别为799.45～1630.58 mg/100 g,228.30～583.15 mg/100 g,238.9～492.6 mg/100 g,即总酚含量＞总酚酸含量＞总黄酮含量。高粱糠中总酚含量为1 127.49 mg GAE/100 g［19］,这与酿酒高粱籽粒中总酚含量相接近,表明高粱籽粒中多酚物质集中于表皮［20］。与其他谷物相比,酿酒高粱籽粒中总酚、总黄酮含量高约为糙米总酚的5～8倍,糙米黄酮的4倍左右［21］。

(2)抗氧化活性检测方法基于以下机理：在特定条件下,检测体系中自由基的清除能力与样品的还原能力反映被测物的抗氧化活性。FRAP铁离子还原能力,样品的还原力越强,抗氧化能力越强。ABTS抗氧化能力,由过硫酸铵氧化作用产生的单阳离子自由基,可与任何羟基化的芳香族化合物反应,与实际抗氧化能力有关［22］,这两种方法均能良好的反映高粱籽粒中抗氧化活性。通过测定酿酒高粱籽粒中游离型与结合型酚类化合物都具有较强抗氧化能力［23］。

(3)不同存在形态的酚类物质对不同体系抗氧化作用存在差异,与酚类物质相对含量、存在形态以及键合方式有关［24］。本研究中酿酒高粱籽粒中,结合酚类物质的抗氧化活性占总抗氧化活性85%以上,这与结合型酚类物质含量远高于游离型酚类物质含量成正相关。结合型酚类物质如何影响其抗氧化能力还需进一步的研究。鉴于酿酒高粱籽粒中含有丰富的多酚类物质与良好的抗氧化活性,可进一步研究发酵过程中多酚等小分子物质变化对发酵风味物质形成的作用［25］。

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