猪细小病毒H株在不同细胞上增殖特性的比较

任德强，张立恒，宋新刚

（哈尔滨元亨生物药业有限公司，黑龙江 哈尔滨 150025）

猪细小病毒(porcine parvovirus，PPV)是引发猪细小病毒病的病原体，可引起胚胎的感染、死亡，母猪不表现比较明显临床症状的繁殖障碍性疾病。目前接种疫苗仍是解决本病的最好方案。为生产出优质的疫苗，需要摸索PPV毒株在不同细胞系上的增殖情况，如不能掌握其规律，生产出足够的抗原，将难以用于生产。PPV只能在猪的细胞和人的某些传代细胞中增殖，且在不同细胞上的生物学特性也不尽相同。通过培养比较，获得培养该病毒滴度高、病变明显的细胞及培养条件，为生产高水平疫苗提供实验数据。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 病 毒 PPV H株，实验室鉴定、保管和供应，经PK15细胞增殖，-70℃保存备用。

1.1.2 细 胞 ST传代细胞购自中国兽医药品监察所；PK15细胞由哈尔滨兽医研究所提供；猪睾丸、猪肾原代细胞取自初生健康仔猪，无菌取睾丸、肾，按常规方法消化，制备原代细胞。

1.1.3 培养基与胰酶 购自GIBCO公司；新生牛血清（NBCS）购自GIBCO公司；胰酶(1：250为GIBCO公司产品。

1.1.4 主要仪器设备 CO2培养箱 (HF240型)，HealForce公司；细胞培养瓶和96孔细胞培养板，美国Corning公司；倒置显微镜(TS100)，Nikon 公司。

1.2 方 法

1.2.1 病毒增殖 待细胞长至30%～50%单层时，弃去营养液，将毒种接种至试验细胞，吸附1h，换含2%血清的维持液至病毒收获。并同时设未接毒对照细胞，至37℃ 5%CO2培养。每天观察并记录CPE情况，当70%～80%细胞出现CPE时收毒，冻融3次，-70℃冰柜保存备用，按此方法试验3次。

1.2.2 HA测定 红细胞按实验室常规方法用pH7.2 PBS配成0.6%豚鼠红细胞悬液备用。测定以上4种细胞培养的病毒液的血凝价。

1.2.3 TCID50测定 96孔微量培养板中每孔加入细胞悬液100μL，将待测病毒液分别作 10-1～10-7倍梯度稀释，每稀释度6孔，每孔加入不同稀释度的病毒液 100mL，细胞对照组加100μL细胞稀释液。置37℃ 5%CO2培养，逐日记录CPE出现孔，观察到120h，按Reed-Muench法计算病毒滴度。

2 结果与分析

2.1 病变情况

PPV-H株接种ST细胞后24h开始出现病变，细胞出现弥漫性颗粒，36h空斑明显增多，48h左右，细胞出现空斑、拉网、脱落现象。CPE可达80%左右，而同时对照组细胞未出现CPE。PPV-H株接种PK15细胞后24h开始出现病变，细胞出现弥漫性颗粒，40h空斑明显增多，60h左右，细胞出现拉网、脱落现象。CPE可达80%左右，而同时对照组细胞未出现CPE。PPV-H株接种猪睾丸、猪肾原代细胞后24h开始出现病变，细胞出现弥漫性颗粒，48h左右，细胞出现空斑、拉网、脱落现象。72h CPE可达80%左右，而同时对照组细胞未出现CPE。

2.2 病毒滴度与血凝价测定结果

结果见表1。

表1 PPV H株在不同细胞上增殖的TCID50和HA

3 讨论与结论

PPV可在多种细胞上生长并导致细胞产生CPE。本研究采用ST、PK15、猪睾丸和猪肾原代细胞增殖该病毒，找到病毒在细胞上的病变特性和规律，确定收毒最佳时机，比较其增殖能力，对疫苗研制和生产起着极重要作用，为该病防控奠定基础。

血凝试验是病毒鉴定和血清学分析的常用手段。PPV对豚鼠红细胞有凝集活性。决定这一特性的是PPV血凝素。PPV凝血活性间接反映其生物活性。为了全面评价不同条件下PPV活性，本研究同时测定病毒含量和其血凝效价。由于PPV增殖需要利用细胞S期的DNA聚合酶。本研究表明PPV接种最佳期是在ST细胞形成30%～50%单层时进行接种，因为这个时期的多数细胞处于细胞合成期，这时细胞多聚酶有利于病毒的复制。另外，牛血清过多会引起免疫猪的过敏反应，用异步法接毒可以降低这种影响，还会保持接毒时细胞的状态稳定。

本研究结果显示，该PPV毒株在ST细胞上出现CPE时间较早，病毒含量和血凝价高，且比其他3种细胞上CPE出现的时间均较早，节省时间和培养成本。因此本试验建议将ST细胞作为增殖PPV-H毒株的首选细胞，这将为疫苗大规模生产提供依据。

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