恩施烟区烤烟黑胫病菌致病力测定及抗性品种差异鉴定

黎妍妍 王文静 王林 李亚培 周红审 陈德鑫 许汝冰 李锡宏

摘 要：为有效进行恩施烟区烟草黑胫病的防控，本研究采用菌丝块茎基部创伤接种法鉴定了恩施烟区烟草黑胫病菌的致病力。根据黑胫病菌菌株接种K326、红花大金元、云烟202后的AUDPC（病害流行曲线下面积）数值进行了聚类分析，将恩施烟区烟草黑胫病菌划分为I、II、III 3种致病型。3种致病型病原菌没有表现出典型的强、中、弱致病特性。7个抗性烟草品种对不同致病型黑胫病菌表现出抗性差异，革新3号对3种致病型菌株均表现出较好的抗性。

关键词：恩施；黑胫病菌；致病力；抗性差异

中图分类号：S435.72 文章编号：1007-5119（2018）05-0094-05 DOI：10.13496/j.issn.1007-5119.2018.05.013

Abstract： In order to take effective measures to control tobacco black shank in Enshi， the virulence of Phytophthora nicotianae was analyzed by using the method of the wounded stalk inoculation with mycelia. Strains could be classified into three virulence pathotypes （I， II and III） by cluster analysis based on AUDPC （Area under Disease Progress Curve） values of three cultivars， K326， Hongda， and Yunyan202. And the three pathotypes showed atypical pathogenic characteristics. 7 resistant tobacco varieties showed different resistance to different pathotypes of Phytophthora nicotianae， and Gexin 3# showed good resistance to all three kinds of pathogenic strains.

Keywords： Enshi； Phytophthora parasitica； pathogenicity； resistant difference

煙草黑胫病是由寄生疫霉烟草致病型[Phytophthora parasitica var. nicotianae （Breda de Haan Tucker）]引起的烟草生产中的一种土传病害，常表现为黑胫、黑膏药、穿大褂、碟片状、腰烂等症状。1950年，烟草黑胫病在中国的黄淮地区首次发现[1]。目前，该病害在我国各主产烟区均有不同程度的发生，且常与烟草青枯病混合发生，故危害更为严重。

烟草黑胫病流行与否取决于病原菌致病性强弱和数量、烟草抗病程度和环境条件[2]，因此，进行黑胫病菌致病力测定与分析是有效进行病害防治的关键。在以往研究中，梁元存等[3]测定了我国黄淮、西南和东南区域等9个主产烟草省（区）的117株烟草黑胫病菌菌株的致病力。王革等[4]报道称，云南省内黑胫病菌菌株比非云南省的致病力强。刘廷利[2]通过测定重庆烟区烟草黑胫病菌菌株的致病性，认为菌株间的致病性分化明显。这些都为不同区域烟草黑胫病的合理防控提供了良好的理论基础。在过去的十几年间，恩施烟区烤烟黑胫病菌的优势生理小种已由0号演变为1号[5-6]，然而，关于该区域烤烟黑胫病菌的致病力尚未进行研究。

在防治黑胫病的诸多措施中，选育抗病品种是最经济、有效、环保的措施[7]，品种抗性鉴定自然成为抗源挖掘利用、抗病育种、抗性监测等工作中重要的一环[8]。目前，诸多研究[9]已进行了种质资源与新品种（系）的抗性鉴定，然而关于抗性品种对不同致病型黑胫病菌的抗性差异鲜有报道。本研究旨在通过分析恩施烟区烟草黑胫病菌致病力差异，并有针对性地进行抗性品种抗性差异鉴定，为该烟区有效进行病害的防控和抗病育种工作的开展提供必要的理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试菌株的采集、分离与鉴定

2016年从湖北省恩施州宣恩县、利川市、恩施市采集烤烟（当地主栽烟草品种为云烟87）黑胫病病株。采用直接表面消毒分离法进行黑胫病菌菌株的分离。将烤烟病株茎秆剖开、冲洗干净并吸干水分，95%的酒精表面消毒后，从碟片状的病健交界处取3 mm×3 mm的髓部组织接种于燕麦培养基（燕麦片30 g，琼脂18 g，去离子水l000 mL）平板上，置于28 ℃温箱中培养2～3 d后挑取边缘菌落进行纯化。

采用CTAB 法提取供试菌株菌丝体总DNA后，运用通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTG CGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATA TGC-3′）对病原菌的ITS序列扩增，进行待测病原菌的分子鉴定。

1.2 黑胫病菌菌株致病力鉴定

参照相关研究[2]，选择抗感差异不同的K326（中抗）、云烟202（抗）、红花大金元（感）作为烟草黑胫病菌致病力测定的鉴别品种。烟苗长至5～6片真叶时，移栽到盆钵内，每盆栽一株烟苗。供试菌株在28 ℃温箱内培养3～5 d后，用直径0.6 cm的灭菌打孔器制成菌饼。采用菌丝块茎基部创伤接种法将供试菌株制成的菌饼接种于每个烟草品种。将5～6叶期的烟苗用昆虫针束（4根小号昆虫针束）轻度刺伤茎基部，将菌饼贴于伤口处（生长菌丝的一面向内与茎基部相贴），用脱脂棉蘸灭菌水覆盖保湿24 h，置于温度28 ℃、相对湿度80%的温室中，每个菌株接种每品种10株烟苗。

1.3 抗性烟草品种抗性差异鉴定

根据黑胫病菌菌株致病力测定结果，以抗黑胫病烟草品种云烟203、云烟201、NC82、NC1071、Florida 301、L-8和革新3号为参试品种，对每种致病型菌株进行室内苗期接种，鉴定参试品种对不同致病型黑胫病菌菌株的抗性差异。接种方法及条件同1.2，每品种8～10株烟苗。

1.4 发病情况调查

于接种后7 d（7dpi， 7 days post-inoculation）、14 d（14 dpi）和20 d（20 dpi）进行调查，依据标准GB/T 23222—2008《烟草病虫害分级及调查方法》中关于烟草黑胫病的分级标准记载发病情况。

1.5 统计分析

依据各菌株在不同烤烟品种上的AUDPC值，采用SPSS 19.0中的系统聚类法进行聚类分析，将黑胫病菌菌株划分为不同的致病型。

2 结 果

2.1 烟草黑胫病菌总体致病力分析

通过对7个菌株进行分子鉴定，并在NCBI上进行序列比对，确定其为烟草疫霉（Phytophthora nicotianae）。由表1可以看出，不同菌株对3个供试烟草品种致病力存在明显差异。接种20 d后，K326、云烟202、红花大金元3个烟草品种的病情指数分别为0～51.11、0～36.11、0～52.22。

2.2 烟草黑胫病菌致病型划分及致病特性

根据黑胫病菌菌株接种3个烟草品种的AUDPC值，对7个菌株进行了聚类分析，将其划分为I、II、III 3种致病型（图1）。

不同的致病型菌株对烟草品种产生不同的侵染特性（表2）。I型致病菌在接种后20 d时，3个烟草品种的平均病指和AUDPC值分别为6.35和37.08，K326品种未见发病，该型菌株对红花大金元的侵染力较强，对云烟202的侵染力较弱；II型致病菌在接种后20 d时，3个烟草品种的平均病指和AUDPC值分别为15.65和62.68，对K326的侵染力较强，但对云烟202和红花大金元的侵染力较弱；III型致病菌在接种后20 d时，3个烟草品种的平均病指和AUDPC值分别为20.06和66.48，该型菌株对云烟202和红花大金元的侵染力较强，但K326未见发病。

2.3 抗黑胫病烟草品种抗性差异鉴定

依据黑胫病菌菌株致病力测定结果，进行了抗性烟草品種抗性差异鉴定（表3）。接种III型（ES-1、ES-2、LC-6）致病型菌株后，革新3号未见发病；接种I型（LC-4、XE-2）致病型菌株后，云烟203、云烟201、NC1071、革新3号未见发病；接种II型（XE-3、XE-4）致病型菌株后，云烟203、革新3号未见发病。总体来看，革新3号对3种致病型菌株均表现出较好的抗性。

3 讨 论

在菌丝块茎基部创伤接种、游动孢子悬浮液灌根接种、菌丝块茎基部不创伤接种3种常用的接种方法中，马国胜等[10]认为菌丝块茎基部创伤接种可能是测定黑胫病菌致病力的最好方法。本研究采用该方法，依据病斑在3个烟草品种上的扩展情况测定分析了恩施烟区烟草黑胫病菌菌株的致病力。

烟草黑胫病菌的致病性分化现象是在病原物与寄主植物长期演化过程中相互适应和相互选择下形成的[11]。研究表明，烟草黑胫病菌致病性强弱的表达与菌株的不同地区来源具有一定关系。梁元存等[3]测定了我国主产烟区的烟草黑胫病菌菌株在10个烟草品种上的致病性分化情况，结果表明我国的烟草黑胫病菌菌株间致病性存在明显差异。本研究根据聚类分析，将恩施烤烟黑胫病菌菌株划分为I、II、III型3种致病型，表明即使处于同一生态区域内，菌株间仍然存在致病性分化现象，这与刘廷利[2]研究结论较为一致。3种致病型病原菌对3个烟草品种的致病性并没有表现出以往报道[2]中的典型致病特性，I型菌对中抗品种K326无致病力，但对感病品种红花大金元的侵染力较强，对抗病品种云烟202的侵染力较弱；II型菌对K326的侵染力较强，但对云烟202和红花大金元的侵染力较弱；III型菌对云烟202和红花大金元的侵染力较强，但对K326无致病力。相对而言，III型菌的致病性高于I型菌。鉴于这种非典型性致病特性，本研究没有将鉴定出的3种致病型病原菌归于强、中、弱。

研究表明，有些烟草品种仅抗黑胫病菌某些生理小种，说明生理小种发生改变可能导致抗性消失[12]。然而，关于烟草抗性品种对不同致病型黑胫病菌的抗性差异鲜有报道。本研究结果表明，对I型致病菌具有抗性的烟草品种较多，而对III型致病菌的抗性品种仅为革新3号。革新3号对I、II、III 3种致病型菌株均表现出较好的抗性。因此，烟草黑胫病菌致病性的差异常常导致某些抗性烟草品种抗病性的“丧失”。

4 结 论

本研究采用菌丝块茎基部创伤接种法鉴定了恩施烟区烤烟黑胫病菌的致病力，将其划分为I、II、III 3种致病型。基于不同致病型黑胫病菌，进行了抗性烟草品种抗性差异评价，结果表明，革新3号对3种致病型菌株均表现出较好的抗性。本研究为该区域烟草黑胫病的合理防控及抗性品种的布局提供了参考。

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