不同病原菌胁迫下青蛤血淋巴转录组中免疫相关基因的比较

赵婷 潘宝平

摘要 利用病原微生物革兰氏阳性藤黄微球菌（Micrococcus luteus）和革兰氏阴性鳗弧菌（Vibrio anguillarum）分别侵染活体青蛤，采用第二代测序MiSeq技术测序，构建了青蛤血淋巴中应答2种病原物的转录组文库。根据KEGG等数据库注释信息对Unigene进行生物学通路注释，预测出青蛤免疫信号通路的差异性表达基因及相关注释信息。结果发现，共注释并筛选出2 605个差异表达基因，其中893个基因注释到15个免疫相关的通路中。该研究可为探索青蛤的免疫识别方式和信号传导路径提供依据。

关键词 青蛤；转录组文库；鳗弧菌；藤黄微球菌；免疫相关基因

中图分类号 S917.4 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2018）27-0084-04

Comparison of Immunerelated Genes in Transcriptome Library of Cyclina sinensis Hemolymph under the Stress of Different Pathogenic Bacteria

ZHAO Ting1， PAN Baoping2

（1.Tianjin Medical College， Tianjin 300222；2.Tianjin Key Laboratory of Animal and Plant Resistance， College of Life Sciences， Tianjin Normal University， Tianjin 300387）

Abstract Cyclina sinensis were injected with Micrococcus luteus and Vibrio anguillarum respectively.

Using the Illumina Miseq system of secondgeneration sequencing technology， two transcriptome library of hemolymph was constructed. Unigene could be annotated to biological pathway by KEGG database to predict differential expression network of immune signaling pathway in C. sinensis. The results showed that 2 605 differentially expressed genes were found and a total of 893 genes annotated to 15 immune related pathways. This research could provide basis for exploring immune recognition and signal transduction pathway in C. sinensis.

Key words Cyclina sinensis；Transcriptome library；Vibrio anguillarum；Micrococcus luteus；Immunerelated genes

基金項目 天津市科委应用基础与前沿技术重点项目（12JCZDJC22800）。

作者简介 赵婷（1988—），女，山东烟台人，助教，硕士，从事生物化学与分子生物学研究。*通讯作者，教授，博士，硕士生导师，从事软体动物分子系统学、海产贝类养殖与病害防治工作。

收稿日期 2018-06-05

青蛤养殖是我国传统的海滨经济产业，蕴含着巨大的发展前景[1]。近年来，由于青蛤养殖产业中出现的高密度投放、种质退化及养殖环境污染等问题，屡次发生病害及大面积死亡现象，给青蛤养殖业造成了巨大的经济损失[2-4]，有关贝类病害问题已成为制约贝类养殖业持续发展的重要因素之一。青蛤的病害防治应从外因和内因2个方面入手，外因方面要求改善贝类的养殖环境，内因方面则要求提高贝类自身的抗病能力，即通过分子免疫学技术寻找物种的免疫相关基因和探索免疫应答机制，最终揭示贝类的免疫调控分子机制并为抗病品系选育提供有价值的数据。

目前，有关贝类转录组的研究已成为贝类免疫学研究的热点，亦成为研究者获得大量免疫抗病基因的有效途径之一。Hou等[5]通过454 高通量测序方法对虾夷扇贝成体各组织和各发育阶段的转录组进行分析，一些与免疫、抗逆性、生长和繁殖相关的基因被发现，为虾夷扇贝的基因组研究和遗传提供重要的平台。Huan等[6]将文蛤不同发育阶段的幼虫进行转录组测序，分析了文蛤 4 个幼虫发育阶段的表达差异，通过对序列拼接及基因功能注释，发现与生长、发育及免疫相关的基因。结合文献检索结果和GenBank中注册青蛤EST的情况可知，国内外对青蛤免疫功能基因的研究刚刚起步[7]，因此构建青蛤转录组文库大规模进行测序是十分必要的。笔者采用第二代测序技术对在不同病原物刺激下的青蛤血淋巴转录组进行了比较，以期为揭示青蛤的免疫应答与免疫调控机制提供有价值的数据，同时也为青蛤养殖实践中的病害防治策略提供新的研究途径。

1 材料与方法

1.1 试验材料

从天津大港海滩沿岸采集的青蛤作为试验材料，随机选取没有损伤、形态大小一致的青蛤样品，暂养于通氧气的海水中，海水密度约1.030 g/cm3，温度保持在22 ℃左右，海水pH 7.0，投喂5‰的小球藻，7 d后做建库试验准备。

1.2 试验方法

1.2.1 侵染试验。

鳗弧菌在28 ℃条件下用2216E大量培养菌株，藤黄微球菌在37 ℃条件下用LB大量培养菌株，分别进行菌液制备。24 h后菌液浑浊，经转速3 000 r/min离心10 min，将2种菌体分别用过滤灭菌的海水清洗3次，去除多余残留培养基，用同样海水重新悬浮菌体，OD600控制在04。随机抽样12只健康青蛤，备用于制备转录组测序样品。然后，采用随机分组的方式分成鳗弧菌刺激组和藤黄微球菌刺激组。在闭壳肌内分别注射等量的菌悬液，分别在注射后6和12 h后取青蛤血淋巴。血淋巴在4 ℃条件下，8 000 r/min离心10 min收集血细胞，加入1 mL Trizol，置于-80 ℃超低温冰箱中备用。

1.2.2 青蛤转录组文库的构建。

采用Trizol法提取青蛤血淋巴总RNA，产物使用QIAGEN公司的Oligotex mRNA Kits进行分离与纯化。纯化后加入裂解缓冲液将mRNA打断成短的片段，采用随机引物逆转录合成cDNA。纯化的双链cDNA再经末端修复、加A尾、加测序接头、连接产物纯化、PCR富集接头连接DNA等步骤完成整个文库的制备。利用Life Tech（Invitrogen）Qubit 2.0荧光计及生化分析儀（Agilent 2100高灵敏度芯片）检测文库质量，检测流程参照其说明书。经质量检测合格的文库使用Illumina MiSeq测序仪上进行pair end双端模式（PE250）测序。

1.2.3 原始数据的预处理及拼接组装。

测序后得到原始图像数据转化成序列数据（Raw data 或 Raw reads），原始测序数据中包含接头信息、低质量碱基和未测出的碱基，通过深度质量控制（QC）过滤筛选，最终得到的数据即为有效数据（Clean data或Clean reads）。统计原始测序数据量以及经过碱基质量控制处理后reads平均长度、reads总数目和总数据量产出等信息。根据样本经过质量控制分析所保留下来的测序reads数据进行样本转录组拼接组装。利用Trinity生物分析软件将短的读长拼接，得到组装片段（Contig），将Contig互相拼接，最后得到具有一定长度的非冗余Unigene。

1.2.4 Unigene Pathway生物通路注释。

KEGG是系统研究基因的生物代谢途径和相关基因功能的大型数据库，利用KEGG数据库对合并拼接的Unigene进行Pathway生物学通路的注释和预测。通过KEGG pathway注释，对免疫相关基因数目进行统计。

1.2.5

差异基因的筛选及表达量分析。

将拼接序列与基因组序列比对，利用编码RNA表达计算，这是通过统计方法估计的表达量，也用于后续样本差异表达量比较分析。RNA表达量的计算采用FPKM计算度量指标。表达量的计算有多种标准化方法，采用参考基因区域内匹配read标准化模式（cufflink软件）计算表达量与差异基因表达。

针对isoform（即Unigene）以及gene（即components）分别进行表达量计算。表达量用PFKM表示，并给出unigene对应NR与Uniprot蛋白数据库的最佳匹配结果作为其注释。表达差异分析就是组间差异表达谱分析。差异分析可分别对基因（gene FPKM）和基因异构体（isoform FPKM，即components）层面分别进行考虑计算。差异分析采用edgeR软件，在R软件环境下实现。表达量差异倍数大于2（FPKM≥2）且FDR<10-5作为筛选标准。

1.2.6 Unigene差异表达基因GO功能分析。

分别对Unigene进行gene以及isoform差异结果的GO富集度分析。GO功能聚类常用于对目标组基因进行功能注释与分类。全部或差异mRNA/基因功能聚类（富集度）分析是采用GO注释系统，功能注释针对全部差异mRNA结果展开。富集度分析采用超几何分布算法和并采用多重假设检验校验超几何分布统计量的P值，获得校正后P值，即q值。

2 结果与分析

2.1 测序数据量统计

对青蛤被藤黄微球菌刺激的样本（样本T）进行测序，共获得12 916 040条Raw reads，去除低质量的和载体序列等，共10 966 322条Clean reads（表1）。青蛤被鳗弧菌刺激的样本（样本M）测序，共获得15 930 210条Raw reads，去除低质量的和载体序列等，共13 389 388条Clean reads（表2）。样本T的测序原始数据量为3.22 G，平均Q20为88.62 %，GC含量平均值为43.10%；样本M的测序原始数据量为3.98 G，平均Q20为87.72 %，GC含量平均值为42.67%。转录组测序质量高，建库成功。

2.2 转录组测序数据的组装拼接效果统计

M样本转录组序列组装拼接完成的总转录本数量为148 238条，拼接完成的总基因数量为62 152条，转录本长度均值（average contig）约618.50 bp。T样本转录组序列组装拼接完成的总转录本数量为137 940条，拼接完成的总基因数量为57 877条，转录本长度平均值（average contig）约644.32 bp。

2.3 免疫相关基因数目统计

通过KEGG pathway注释（E值≤10-5作为筛选标准），共893个基因注释到15个免疫相关pathway，T细胞受体信号通路的免疫防御基因居多，其次是趋化因子信号通路，白细胞跨内皮迁移，FcγR介导的吞噬作用及Toll样受体信号通路中也包含大量免疫防御相关基因（表3）。经序列同源性比较、功能基因注释和代谢途径分析，此次转录组测序中发掘青蛤免疫防御系统的相关抗病因子，主要有热冷休克蛋白家族、亲环素、非消化性的酶和酶抑制剂家族、抗菌肽家族、Toll样受体家族及其下游信号因子等。

2.4 Unigene差异表达分析

由图1可知，青蛤經过革兰氏阳性菌藤黄微球菌和革兰氏阴性菌鳗弧菌的分别刺激，共得到2 605个差异表达基因，其中1 091个基因样品M中上调表达（样品T中下调）和1 514个基因在样品T中上调表达（样品M中下调）。

2.5 差异表达基因Pathway功能富集分布

由图2可知，共1 942个差异基因被注释到KEGG并显著富集到110个pathway。差异基因主要集中在以下通路：亨廷顿氏病、帕金森病、非酒精性脂肪性肝病、抗原加工提呈、类风湿性关节炎。差异基因被富集到110个pathway中，有11个pathway与免疫相关（该研究中有15个与免疫相关pathway被注释到）。它们分别为造血细胞谱系、补体系统、Toll样受体信号通路、RIG-I样受体信号通路、自然杀伤细胞介导细胞毒性、抗原加工提呈、B细胞受体信号通路、FcεRI信号通路、FcγR-介导吞噬、白细胞跨内皮迁移、趋化因子信号通路。

3 讨论与结论

青蛤是具有高经济价值的海洋经济动物，近年来研究表明，引发青蛤养殖大规模病害和死亡的最主要因素是病原菌

的感染[8]。目前研究表明微球菌可以引发水产动物发生疾病，如变异微球菌（Micrococcus varians）是牙鲆出血病的病原菌，患病牙鲆会表现出上下颌出血发红，体表弥散性出血。与水产动物病害相关的革兰氏阳性菌广泛分布并造成大面积病害，如藤黄微球菌（Micrococcus luteus）分散在水、土壤、空气、植物和动物表面，一般会引起伤口等局部组织的感染，也可能会引起严重感染[9-10]。彭彬等[11]从患出血性疾病的黄鳝体内首次分离到藤黄微球菌，这也是首次在水生动物体内分离到病原菌藤黄微球菌。革兰氏阳性菌生长过程中细胞会分泌外毒素，会引起机体的免疫反应，一定时间内大量免疫活性物质活性将在一定程度上升。鳗弧菌（Vibrio anguillarum）是青蛤疾病的重要病原微生物，鳗弧菌的致病性与其自身的一些有毒物质有关[12]，在脂多糖、胞外蛋白酶、溶血素等许多毒力因子的共同作用下，引发青蛤大规模病害甚至死亡的现象[13]。弧菌的致病过程首先通过吸附宿主细胞，侵入细胞中，在体内大量进行增殖，发出有毒的物质进而导致宿主死亡[14]。笔者所在课题组前期研究表明一定浓度的鳗弧菌胁迫青蛤后，其会产生大量免疫相关的活性物质，相关免疫基因的表达也会发生一定程度的上调[15-17]。

为深入探索导致贝类病害和死亡的主要病原细菌及动物的抗逆机制，国内外对于贝类转录组的研究已有报道[18]，包括对多种经济贝类进行了高通量测序，均获得了大量的EST 序列。贝类免疫系统中的免疫防御相关的抗病因子，包括免疫识别信号Toll样受体因子及其免疫信号通路以及下游的热休克蛋白、亲环素、非消化性的酶和酶抑制剂、抗菌肽等，为探索贝类免疫应答方式、免疫识别防御系统及其调控网络提供了大量有价值的实验数据。该研究利用第二代高通量测序技术对青蛤的血淋巴细胞的转录组文库进行建库及注释分析，在确保获得的转录组拼接结果良好的条件下，共筛选到893个免疫相关基因，并将其注释到15个免疫相关的信号通路中。综合序列同源性比较和功能基因注释信息，发现青蛤多种免疫防御相关抗病基因，特别是在Toll样受体信号通路中，MyD88样转接蛋白（Mal）、Trif 相关转接分子（TRAM）、泛素连接酶（TRAF6），转录因子 NF-κB及抑制物 IκB等免疫相关基因在此次青蛤转录组测序中首次被拼接和注释到，为后续研究青蛤Toll信号通路信号传导机制奠定重要基础[19]。

在水产动物的免疫研究中，采用外界病原生物刺激的方法获得大量差异表达基因，这为后期综合分析其免疫应答方式和免疫防御提供数据支持。Astrofsky等[20]将白斑病毒感染后的蓝虾与健康蓝虾进行基因表达差异比较，获得32个差异表达基因，其中某些差异表达基因与提高蓝虾抗病能力密切相关，该研究为选育抗病品种奠定坚实基础。Huvet等[21]利用亮弧菌分别刺激抗性牡砺和易感性牡砺，通过基因表达的比较分析，共获得150个差异表达基因，经分析抗性牡砺和易感性牡砺存在免疫防御功能方面存在差异。该研究利用革兰氏阳性菌和阴性菌刺激青蛤后，从构建的转录组文库中拼接获得了2 605个差异表达基因。在上述差异表达基因中，有1 091个基因在样品M中上调表达（相对于样品T），而1 514个基因在样品T中上调表达（相对于样品M）。此外，通过对差异基因Pathway功能富集，其中共有1 942个差异基因显著富集到110个通路中，其中有11个pathway跟免疫相关。上述试验结果表明青蛤为应答不同病原物的入侵，不同免疫因子参与免疫应答反应，而特定基因的差异性表达证明其对于革兰氏阳性菌和阴性菌的识别和清除作用有一定的差异。综上所述，该研究结果为后期研究青蛤的先天性免疫的应答机制以及病害防治提供新途径。

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