安徽省10个日本沼虾群体遗传多样性微卫星分析

陈 静，宋光同，何吉祥，黄 龙，吴本丽，汪 翔，武 松

(安徽省农业科学院水产研究所，合肥 230031)

日本沼虾(Macrobrachiumnipponense)俗称青虾、河虾，隶属甲壳纲(Malacostraca)十足目(Decapoda)长臂虾科(Palaemonidae)沼虾属(Macrobrachium)，广泛分布于我国各淡水水体，是我国一种经济价值较大的淡水虾类[1-4]。随着日本沼虾养殖业的快速发展，出现了如种质资源退化，性早熟、生长慢、规格变小、抗病力下降等一系列的问题；另外，由于无序开发及天然生境的变化等因素使得野生优异种质也遭到一定程度的破坏，资源量下降，限制了日本沼虾的可持续发展。因此，日本沼虾的种质资源研究逐渐被重视并广泛开展[4-10]。

安徽省地跨长江、淮河、新安江三大流域，境内巢湖是全国五大淡水湖之一，水资源相当丰富，是我国日本沼虾的主产区之一，其中2016年养殖产量为5.31万t，位居全国第二[11]。目前仅见姜虎成等[7]对淮河安徽段日本沼虾的遗传多样性进行了研究，未见安徽其他水域日本沼虾的遗传多样性相关报道。本研究采用微卫星技术对安徽主要水域的日本沼虾进行遗传多样性研究，客观评价安徽日本沼虾的遗传结构和种质资源现状，为日本沼虾种质资源保护和合理挖掘利用以及良种选育提供基础资料和理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料

2016年10月，采集安徽省日本沼虾主要野生群体6个，养殖群体4个(表1)。样品活体运回测量形体指标后取其腹部肌肉，-20 ℃保存备用。

表1 日本沼虾样本采集地点及数目Tab.1 Sample sites and numbers of M.nipponense

1.2 方法

1.2.1 基因组DNA提取

采用天根生化科技(北京)有限公司的组织基因组提取试剂盒(DP304)提取基因组 DNA，用1%琼脂糖凝胶电泳检测完整性后，用紫外分光光度计检测 DNA 的纯度和浓度，并稀释至10 ng/μL，-20 ℃保存备用。

1.2.2 微卫星检测

根据公开发表的日本沼虾多态性较好的微卫星标记[10，12-13]，选取20个标记经初步PCR筛选后，挑选出重复性好、多态性较高的微卫星标记10个(表2)，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成引物。各对引物的正向引物5′端分别带有FAM(蓝色)或HEX(绿色)的特异性荧光标记用于测算扩增目的条带的大小。

PCR 反应体系为15 μL，包括模板DNA 1 μL，10×buffer 1.5 μL，MgCl2(25 mmol/L)1.5 μL，dNTPs(10 mmol/L)各0.3 μL，上下游引物(10 pmol/L)各0.15 μL，Taq DNA 聚合酶(5 U/μL) 0.3 μL。PCR程序为：94 ℃预变性3 min；进入35个循环，94 ℃ 30 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 30 s；循环结束后72 ℃延伸3 min。

将PCR产物委托上海捷瑞生物工程有限公司进行SSR分型。10倍稀释的PCR产物1.5 μL、ROX 500内标0.25 μL和超纯去离子甲酰胺12.5 μL充分混匀后，95 ℃变性5 min，迅速冰浴3 min，置ABI 3700XL测序仪进行毛细管电泳检测。

表2 10对微卫星引物的特征Tab.2 Sequence haracteristics of 10 pairs of microsatellite primers

1.2.3 数据统计及分析

用 Genographer 软件根据分子大小对扩增结果读带，统计每个引物在不同个体中的扩增情况。利用POPGENE 32统计分析各群体每一个微卫星位点的等位基因数(Na)、有效等位基因数(Ne)、观测杂合度(Ho)、期望杂合度(He)、群体间遗传距离(D)。利用ARLEQUIN3.5[14]进行群体间遗传分化指数和群体分子方差分析。利用Picalc程序包[15]计算各引物的多态信息含量(PIC)。基于Nei’s遗传距离利用MEGA 5软件进行UPGMA聚类分析。

2 结果

2.1 微卫星位点的多态性

根据预扩增结果选取特异性强、重复性好和多态性较高的10对引物，对10个日本沼虾群体共300个个体的基因组 DNA 进行扩增，结果显示，各对引物表现出不同程度的多态性(表3)，其平均等位基因数(Na)、平均有效等位基因数(Ne)、平均观测杂合度(Ho)、平均期望杂合度(He)、多态信息含量(PIC)分别为23.9、7.83、0.685、0.875、0.864，所检测的10个位点均属于高度多态位点(PIC>0.5)。

表3 日本沼虾10个微卫星位点的遗传多态性Tab.3 Allelie variability of 10 microsatellite loci of M.nipponense

2.2 群体遗传多样性

10个日本沼虾群体的遗传多样性见表4。女山湖群体的平均Na、平均Ne、平均He和PIC均最高(Na=15.6、Ne=9.196、He=0.876、PIC=0.851)，升金湖群体的平均Na、平均Ne、平均Ho、平均He和PIC均最低(Na=12.4、Ne=6.427、Ho=0.64、He=0.795、PIC=0.753)，Ho最高的群体为巢湖群体(Ho=0.723)。综合各参数，10个日本沼虾群体均具有较高的遗传多样性，并以女山湖群体的遗传多样性最高、升金湖群体的遗传多样性最低。

表4 10个日本沼虾群体的遗传多样性Tab.4 Genetic diversity among 10 populations of M.nipponense

2.3 群体间的遗传变异

分子方差分析如表5所示，10个日本沼虾群体中的遗传变异96.36%存在于群体内，仅有3.64%的遗传变异来自于群体间，但各群体间遗传变异极显著(P<0.01)。

10个日本沼虾群体间遗传分化指数(Fst)和Nei’s遗传距离如表6所示。群体间Fst介于0.002 8～0.114 4，属于中低水平遗传分化(Fst<0.15)，其中女山湖群体和太湖1号F2群体之间的遗传分化水平最低(Fst=0.002 8)，升金湖群体和滁州群体遗传分化水平最高(Fst=0.114 4)。群体间Nei’s遗传距离为0.039 8～0.226 0，其中女山湖群体和太湖1号F2群体之间的遗传距离最近(D=0.039 8)，升金湖群体和滁州群体遗传距离最远(D=0.226 0)。

根据遗传距离构建UPGMA 聚类树，如图1所示，当涂和南漪湖群体聚在一起，太湖1号F2代与女山湖群体聚在一起，升金湖和长江东至段群体聚在一起。

表5 10个日本沼虾群体的 AMOVA 分析Tab.5 AMOVA analysis among 10 populations of M.nipponense

注：＊＊1023次模拟检验后显示为极显著(P<0.01)

3 讨论

3.1 荧光SSR分型更高效更准确

微卫星标记是分布于真核生物基因组中的简单重复序列(simple sequence repeats，SSRs)，也称短串联重复序列(simple tandem repeats，STRs)，因其在基因组中分布广泛、具较高的多态性、呈共显性遗传等特点被广泛应用于水产生物种群遗传多样性分析、种质资源保护、遗传图谱建立和 QTL 定位等研究中[16，17]。传统的SSR片段分离采用聚丙烯酰胺凝胶电泳加银染或放射显影的方法，费时费力且分辨率较低。本研究利用目前被广泛采用的毛细管电泳技术，通过荧光标记的PCR引物扩增微卫星位点区域序列，利用 ABI 遗传分析仪对荧光标记的DNA 片段进行毛细管电泳检测，结合分子内标计算DNA片段长度，使SSR分型更高效与准确[18]。

表6 10个日本沼虾群体间的Fst(对角线下)和Nei’s遗传距离(对角线上)值Tab.6 Genetic differentiation coefficient (below diagonal) and Nei’s genetic distance (above diagonal)among 10 populations of M.nipponense

图1 基于遗传距离构建的10个日本沼虾群体的UPGMA聚类树Fig.1 UPGMA clustering tree based on genetic distance of 10 populations of M.nipponense

3.2 遗传多样性

多态信息含量(PIC)是一个评价基因座位在群体中的多样性程度的标准，平均PIC是衡量等位基因片段多态性的理想指标。当PIC>0.5时，该位点为高度多态位点；0.250.5)，可用于日本沼虾群体的遗传多样性及遗传结构的评估，同时，10个日本沼虾群体也均属于高度多态(PIC>0.5)。

杂合度又称为基因多样度，一般被认为是度量群体遗传变异的最适参数[20]。若群体平均杂合度高于0.5，表明该群体未受到高强度的选择，拥有丰富的遗传多样性；若群体平均杂合度低于0.5，表明该群体遗传多样性较低。Ho容易受样本大小的影响，而He更能够反映群体的遗传多样性[21]。武小斌等[5]利用22个微卫星标记分析了白洋淀、衡水湖、微山湖和洪泽湖4个地区日本沼虾野生群体，结果显示各群体的He介于0.515 6～0.540 3。黄有辉[6]利用7个微卫星标记分析了日本沼虾主要产地的10个野生群体(白洋淀、微山湖、太湖、淀山湖、高邮湖、洞庭湖、鄱阳湖、龙感湖、洪湖、贵州)，结果显示各群体的He介于0.541～0.742。

研究中，安徽省10个日本沼虾群体的平均He介于0.795～0.876，4个养殖群体也均具有较高的遗传多样性(He=0.821～0.853)，甚至超过上述报道的各野生群体，可能是与养殖群体每年都补充部分野生亲本进行种质改良有关。总之，安徽省10个日本沼虾群体均具有较高的遗传多样性及选育潜力。

3.3 群体间遗传变异

Hamrick等[22]认为以异交为主的物种，90%的遗传变异发生在群体内部，研究中AMOVA 分析结果表明，仅3.64%的遗传变异来自于群体间，有96.36%的遗传变异存在于群体内部，与上述结论一致。群体间显示，群体间遗传分化指数介于0.002 8～0.114 4之间，属于中低水平遗传分化(Fst<0.15)[23]。安徽省日本沼虾6个野生群体的Fst大小和聚类顺序都与实际的地理位置分布较为一致，姑溪河、南漪湖、长江东至段和升金湖均属于长江水系，其中姑溪河群体和南漪湖群体的遗传分化指数最小(Fst=0.008)，而属于淮河水系的女山湖群体和升金湖群体的遗传分化指数最大(Fst=0.082 3)，日本沼虾4个养殖群体的聚类也与就近的野生群体相靠近。马克异等[9]在研究钱塘江日本沼虾的遗传变异时，也得出地理位置的远近与Fst 的大小具有相关性，这可能与日本沼虾的生活习性相关，日本沼虾游泳能力较弱，只能作短距离的游动，多数时间攀附于水草或其他水中物体上，仅在幼苗时期随水流或者人为携带而被动扩散[4]。

安徽省10个日本沼虾的遗传多样性和遗传结构研究表明，10个群体均具有较高的遗传多样性，6个野生群体遗传分化和聚类顺序与所处的地理位置分布较为一致。本研究为安徽日本沼虾种质资源的深入研究提供一定的参考，并为其良种选育过程中亲本的选择策略提供理论基础。

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