基于线粒体COI和Cytb基因序列的6种锦鲤(Cyprinus carpio Koi)遗传多样性分析

李梦荣，田 雪，庞小磊，王良炎，胡 菊，董传举，李学军，王团记

(河南师范大学水产学院，河南新乡 453007)

锦鲤(CyprinuscarpioKoi)属于鲤形目(Cypriniformes)鲤科(Cyprinidae)鲤属(Cyprinus)。鲤科为鱼类中最大的一个科，分布广泛[1]。锦鲤体表被鳞色彩艳丽、花纹多变，具极高的观赏和饲养价值，是风靡当今世界的一种体型较大的观赏鱼类，素有“会游泳的艺术品”、“水中活宝石”等美称[2，3]。经过200多年的培育，锦鲤中出现了众多品系，可分为13类126种[4]，锦鲤品系一般由杂交和长期的人工选择获得，在观赏和养殖过程中主要是以色斑来进行挑选与分类，因此，即使表形特征一样的个体，其基因型却可能存在极大的差异，这也导致其遗传背景十分复杂，体色变化有很强的不确定性，所以在养殖过程中找到体色稳定遗传的锦鲤必须万中挑一[5]。

现今，关于鲤科鱼类种属间系统发育关系的报道较多，但锦鲤养殖品系间的亲缘关系研究很少，多利用形态学[6，7]或微卫星标记[8，9]方法对红白锦鲤、昭和锦鲤、大正锦鲤和乌鲤进行遗传分析，其它主要养殖品系间的遗传差异尚不清晰。鱼类线粒体基因是结构高度紧凑的共价双链闭环分子[10]，长度约为15～20 kb[11]，具有分子小、进化速度快、结构简单和母性遗传[12]等特点，在分子遗传学领域应用较多。本研究以河南师范大学水产养殖基地培育的6个锦鲤养殖品系为研究对象，利用线粒体COI和Cytb基因分析锦鲤养殖品系间的遗传差异，探讨各品系间的进化和亲缘关系，为锦鲤的系统进化提供分子生物学依据，也为优质锦鲤选育提供参考资料。

1 材料与方法

1.1 研究样品来源及总DNA提取

6个锦鲤品系为河南师范大学水产养殖基地培育，表1为品系的名称和数量等信息。酚-氯仿抽提法从锦鲤鳍条组织中提取总DNA，1%琼脂糖凝胶电泳检测其质量。

表1 锦鲤品系的名称和数量Tab.1 C.carpio Koi sample names and quantity

1.2 COI和Cytb基因扩增及序列测定

根据NCBI中锦鲤COI基因和Cytb基因序列设计特异性引物进行PCR扩增，具体引物序列如下：正向引物COIF(AGTATAAGCGTCTGGGTAGTC)、CytbF(AACCACCGTTGTATTCAACTACAA)和反向引物COIR(CCTGCAGGAGGAGGAGAYCC)、CytbR(ACCTCCGATCTTCGGATTACAAGACCG)，由武汉天一辉远生物科技有限公司合成。PCR反应体系：2×PCR Taq MasterMix12.5 μL、上下游引物(10 μmol/L)各0.75 μL、DNA模板1 μL，补足dd H2O到25 μL。PCR扩增条件为：预变性94 ℃ 3 min，变性94 ℃ 30 s，退火60 ℃ 1 min，延伸72 ℃ 1 min，共30个循环，终延伸72 ℃ 5 min。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测后，送武汉天一辉远生物科技有限公司、金斯瑞公司和生工进行测序。

1.3 序列分析

测序结果用Clustalx 2.1软件进行比对，MEGA7.0[13]计算线粒体COI和Cytb基因序列的碱基组成，确定变异位点和简约信息位点的个数，群体内和群体间的遗传距离。DNAsp v.5[14]统计单倍型个数，计算单倍型多样性(Haplotype diversity，Hd)和核苷酸多样性(π)等。Arlequin3.1[15]计算品系间的遗传分化系数等。MEGA7.0软件中的邻接法(Neighbor-Joining，NJ)构建单倍型和品系全部个体的系统进化树，系统树各节点支持率采用Bootstrap 1 000次重复检验置信度[16]。

2 结果

2.1 序列与单倍型分析

用于进行品系间分析的COI基因序列长602 bp，A、T、G、C的平均碱基含量分别为26.6%、30.4%、18.5%、24.5%。其中包括594个保守位点，8个变异位点，3个简约信息位点。COI基因中检测到的7种单倍型及单倍型序列变异位点见表2，其中H1、H2、H4为群体间共有单倍型， H3为黑锦鲤(HL)所特有，H5为全白锦鲤(QB)所特有，H6、H7为全红锦鲤(QH)所特有。

用于进行品系间分析的Cytb基因序列长1 117 bp，A、T、G、C的平均碱基含量分别为29.5%、26.5%、13.8%、30.2%。其中包括1 102个保守位点，15个变异位点，12个简约信息位点。Cytb基因中检测到的6种单倍型及单倍型序列变异位点见表3，其中HH1、HH2、HH4为群体间共有单倍型，HH3为HL所特有，HH5为QB所特有，HH6为QH所特有。

6个锦鲤品系基于COI和Cytb基因序列的遗传多样性结果如表4所示，COI基因序列Hd在0.436±0.133～0.709±0.083之间，π在0.000 7±0.000 2～0.003 0±0.000 6之间。Cytb基因Hd在0.318±0.164～0.709±0.083之间，π在0.001 6±0.000 5～0.005 0±0.001 0之间。所有品系COI和Cytb的Tajima’s D中性检验结果为-1.370 7～1.448 8、-1.704 6～1.905 7，中性检验结果均不显著(P>0.05)，符合中性突变。

表2 COI基因单倍型及在6个品系的分布Tab.2 Haplotypes of COI gene and its distribution in 6 varieties

表4 6个品系基于线粒体COI和Cytb基因序列的遗传多样性指数Tab.4 Genetic diversity index base on COI and Cytb sequence in 6 varieties

2.2 品系间的遗传距离及遗传分化

利用线粒体COI和Cytb基因序列比较6个品系的遗传分化系数，根据软件AMOVA结果显示，品系内遗传差异高于品系间的差异(表5)。 表6所示，基于COI基因的6个养殖品系群体间遗传分化系数FST在-0.029 1～0.623 8之间，SS和QB之间的遗传差异最大，为0.623 8，HL和QH间遗传差异最小，为0.059 9；HJ和QB之间的遗传距离最近，为0.001 6，SS和QH之间的遗传距离最远，为0.003 6。并且QB品系内遗传距离最小，为0.000 7，HL的种内遗传距离最大，为0.003 0，经比对，遗传距离与FST分析结果基本一致。

基于Cytb基因的6个养殖品系FST在-0.041 5～0.690 2之间，SS和QH间遗传差异最大，为0.690 2，HJ和QH间遗传差异最小为0.108 0；QH和QB之间的遗传距离最近，为0.003 0，SS和QH之间的遗传距离最远，为0.007 2。此外，QB品系内遗传距离最小，为0.001 6，HL的种内遗传距离最大，为0.005 0，经比对，遗传距离与FST分析结果基本一致(表7)。

表5 6个品系线粒体COI和Cytb序列的AMOVA结果Tab.5 The result of AMOVA based on COI and Cytb gene of mtDNA in 6 varieties

表6 基于COI基因的6个品系间平均遗传距离、FST值及各个品系内平均遗传距离Tab.6 average genetic distance between and within 6 varieties and FST

注:对角线以上为群体间的遗传距离，对角线以下为群体间的FST，*表示差异显著(P<0.05)。表7同。

表7 基于Cytb基因的6个品系间平均遗传距离、FST值及各个品系内平均遗传距离Tab.7 average genetic distance between and within 6 varieties and FST

2.3 系统进化树

根据COI基因和Cytb基因单倍型构建品系之间的NJ系统进化树(图1、2)。从图1、图2中得到，6个品系可分为三支， HL、QH聚为一支；SS、HB、HJ聚为一支，QB单独聚为一支。因此，HL和QH亲缘关系较近，SS、HB和HJ亲缘关系较近,QB与其他品系的亲缘关系均较远。

图1 基于邻接法构建的COI基因单倍型系统发育树Fig.1 Neighbor-joining tree of COI gene haplotypes

图2 基于邻接法构建的Cytb基因单倍型系统发育树Fig.2 Neighbor-joining tree of Cytb gene haplotypes

3 讨论

3.1 序列及单倍型

本研究分析并比较了6个锦鲤养殖品系线粒体COI和Cytb基因部分序列的碱基差异。结果显示锦鲤各品系COI和Cytb基因序列中G含量最低(18.5%/13.9%)，且AT含量(57%/56%)明显高于GC含量(43%/44%)，这与鱼类线粒体基因碱基组成中存在的反G偏倚现象相一致，大部分生物基因组中出现的碱基偏向性现象十分广泛，且不同种属的碱基不均衡程度也不尽相同[17]。产生这一现象的原因有：基因长度、基因的表达水平、碱基组分以及密码子反密码子间的结合能力等[18]。

7个COI基因单倍型中单倍型H1、H2和H4为群体所共有，且这3种单倍型的个体数为51个，占总数的82.26%， 6个Cytb基因单倍型中H1、H2和H4单倍型为群体所共有，且具有这3种单倍型的个体数为52个，占总数的83.87%，推测单倍型H1、H2和H4很可能是较原始的单倍型类型。基于COI和Cytb基因研究的6个品系中红白锦鲤均具有最高的Hd值，黑锦鲤具有最高的π值，这可能与锦鲤的选育历史有一定的关系，Kock等[19]研究证实：黑锦鲤和红白锦鲤处于较原始的位置，通常以黑锦鲤和红白锦鲤为亲本选育其他品系类型。

3.2 群体间的亲缘关系分析

单倍型结果显示，COI基因和Cytb基因都能够区分其中一些品系(黑锦鲤、全白锦鲤、全红锦鲤)，但多数品系不具有独特的单倍型(所有的品系共享单倍型H1；黑锦鲤、三色锦鲤、红白锦鲤共享单倍型H2；三色锦鲤、红白锦鲤、黄金锦鲤、全红锦鲤共享单倍型H4)，遗传距离结果与单倍型结果一致，SS、HB、HJ遗传距离较近，SS和QH之间的遗传距离最远。NJ系统进化树结果同样显示，黑锦鲤和全红锦鲤亲缘关系较近，三色锦鲤、红白锦鲤和黄金锦鲤亲缘关系较近，全白锦鲤单独聚为一支。锦鲤杂交遗传图谱、Pietsch等[20]和Kock等[19]的研究显示，黑锦鲤和全红锦鲤由铁真鲤(C.carpioTetsu Magoi)选育而来，因此它们的亲缘关系较近，聚为一支。红白锦鲤和黄金锦鲤由浅黄真鲤(C.carpioAsagi Magoi)选育产生，三色锦鲤由红白锦鲤选育而来，因此它们的亲缘关系较近，聚为一支。全白锦鲤虽然也由浅黄真鲤选育产生，但选育过程冗长，经历了多代杂交筛选，与其他品系的亲缘关系相对较远，但不排除个别个体与其他品系的亲缘关系较近。除全白锦鲤外，黑锦鲤、全红锦鲤和三色锦鲤、红白锦鲤、黄金锦鲤存在一定的交集，产生这种结果的原因可能是与锦鲤选育历史和市场流行趋势相关，现今品系选育大都以观赏性状为目标，通过种间杂交达到培育优质锦鲤的目的，也导致锦鲤基因杂合度高，遗传背景复杂。

3.3 单倍型分析的可行性

相较于其他分子标记，DNA序列分析[21]可更准确直接地反映物种的遗传多样性。鱼类线粒体基因中，COI基因和Cytb基因具有进化速率适中、易扩增、易排序[22]及富含系统发育信息[23]等优点，被广泛应用于种群遗传多样性研究、鱼类种质资源状况调查、物种鉴定及分子系统发育探究[7，24-27]。

本实验利用线粒体COI和Cytb基因对6个锦鲤养殖品系进行遗传多样性分析，明确品系间亲缘关系，为培育优质锦鲤品系提供研究基础，为锦鲤的遗传选育和种质保护提供一定的理论数据。

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