白藜芦醇对糖尿病大鼠视网膜Bcl⁃2和Bax表达的影响

李青春 邢怡桥 李岱

1湖北科技学院眼科教研室（湖北咸宁437100）；2武汉大学人民医院眼科中心（武汉430060）

糖尿病视网膜病变（diabetic retinopathy，DR）是糖尿病最常见的微血管并发症，也是全球最常见的致盲性眼病之一。近年来研究［1⁃2］证实，视网膜神经细胞的凋亡是DR的关键组成部分，对其凋亡的干预，能够抑制或延缓DR的发生发展。有研究发现，糖尿病大鼠视网膜神经细胞凋亡与Bcl⁃2和Bax等相关［3］。白藜芦醇（resveratrol，Res）是一种多酚类化合物，具有广泛的生物和药理活性。有研究表明［4］Res具有抗凋亡作用，但作用于DR的机制尚不明确。因此，本研究拟通过观察Res对糖尿病大鼠视网膜中Bcl⁃2和Bax表达的影响，探讨Res防治DR的可行性。

1 材料与方法

1.1 实验试剂 Res和STZ均购自美国sigma公司，Bax、Bcl⁃2 单克隆抗体均购自美国 Cell Signal⁃ing Technology公司，SP、DAB试剂盒均购自武汉赛维尔生物科技有限公司。

1.2 动物的造模及分组 SPF级雄性SD大鼠35只由湖北科技学院动物实验中心［许可证号：SYXK（鄂）2013⁃0071）］提供，平均体质量（250±10）g。随机选取其中10只大鼠作为正常对照组（Control组），注射等量的柠檬酸缓冲液，而另外25只参照付书华等［5］的方法制备糖尿病模型。最终20只大鼠血糖达到要求，被作为糖尿病模型大鼠。用随机数字表法将20只糖尿病模型大鼠分为糖尿病组（DM组）和Res药物干预组（DM+Res组），每组10只。DM+Res组每日按20 mg/（kg·d）量［6］给予Res灌胃1次（将Res溶于0.5%羧甲基纤维素制成混悬液）；Control组及DM病组均给予容量与体质量相同的生理盐水灌胃，连续灌胃12周后处死，并取其眼球。

1.3 实验方法及结果判定 各组大鼠眼球行常规固定、包埋、切片、HE染色后每张切片随机取5个视野（400×）观察大鼠视网膜形态变化并拍照。在距离锯齿缘附近500～600 μm处随机选取3个点测定视网膜全层及内核层、外核层的厚度［7］。免疫组织化学法按SP试剂盒操作步骤实施，胞内有棕黄色颗粒的为阳性细胞。每组取5张切片，每张切片随机选取5个视野，选取相同的放大倍数（400×）和光强度对切片上免疫组织化学阳性染色进行测定。Image⁃Pro Plus6.0软件下分析照片，得出阳性的累积光密度值（IOD），Bcl⁃2和Bax表达量与IOD值成正比。

1.4 统计学方法 采用SPSS 19.0软件对数据进行统计分析。计量数据采用±s表示，两两比较采用t检验，多组数据比较采用单因素方差分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Res对视网膜厚度的影响 与Control组相比，DM组大鼠视网膜总厚度、内核层及外核层厚度均显著减少（P＜0.01，图1A）；与DM组相比，DM+Res组大鼠视网膜总厚度、内核层及外核层厚度均显著增厚（P ＜ 0.05，图1B、C、D）。Control组与DM+Res组大鼠视网膜总厚度、内核层及外核层厚度相比差异无显著性（P＞0.05）。

图1 Res对视网膜形态和视网膜厚度的影响Fig.1 Effect of Res on the morphology and thickness of retinas in diabetic rats

2.2 Res对视网膜Bcl⁃2和Bax表达的影响 Bcl⁃2和Bax免疫阳性产物呈棕黄色细颗粒状，位于细胞浆内，主要分布于视网膜神经节细胞层及内核层。见图2A。与Control组相比，DM组Bcl⁃2表达减弱（P ＜ 0.01），Bax表达增强（P ＜ 0.01），Bcl⁃2/Bax比值下降（P ＜0.01）；与DM组相比，DM+Res组Bcl⁃2表达增强（P ＜0.01），Bax表达减弱（P ＜0.01），Bcl⁃2/Bax比值上升（P ＜ 0.01）。见图2B、C、D。Control组与DM+Res组大鼠视网膜Bcl⁃2、Bax蛋白表达及Bcl⁃2/Bax比值差异无显著性（P＞0.05）。

图2 Res对视网膜Bax和Bcl⁃2表达的影响Fig.2 Effect of Res on Bax and Bcl⁃2 expression in retinas of the diabetic rats

3 讨论

早在20世纪90年代末，视网膜神经退行性病变的概念就被提出。近年来研究［8］表明视网膜神经损伤在DR发生发展中愈发突出，其主要表现为视网膜厚度变薄及凋亡细胞数增加等。Res是一种多酚类化合物，具有广泛的生物和药理活性，前期研究发现其对白内障、青光眼、年龄相关性黄斑变性等眼部疾病具有防治作用［9］。本研究发现Res可显著抑制糖尿病大鼠视网膜总厚度、内核层和外核层厚度变薄；且与正常对照组大鼠视网膜厚度差异无显著性，表明Res可通过减轻糖尿病大鼠视网膜的病理变化，延缓DR的进程。

有研究［10］表明视网膜神经损伤是由多种凋亡相关基因参与的调控过程。其中负责编码的Bcl⁃2蛋白，能阻止多种信号通路阻断细胞凋亡、延长细胞的存活期；而Bax是一种能促使或介导细胞凋亡的线粒体膜蛋白［11］，一定条件下两者可相互结合成二聚体。当Bcl⁃2表达过量时，便形成Bcl⁃2/Bcl⁃2同源二聚体，抑制细胞凋亡，使细胞受到保护；而当Bax过度表达时，不仅可与Bcl⁃2形成Bcl⁃2/Bax异源二聚体，拮抗Bcl⁃2抑制凋亡的作用，还可与Bax形成Bax/Bax同源二聚体，激活Caspases介导的细胞凋亡［12］。Bcl⁃2/Bax的比值可反映 Bcl⁃2和Bax在细胞凋亡中的效应，两者的平衡能保证细胞的稳态，比值的变化是细胞存活或凋亡的决定因素［13］。当 Bcl⁃2/Bax比值升高时，其效应是抑制细胞凋亡，反之，则是促进细胞凋亡。

有研究证实Res可通过增加Ca2+/钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ的活性，抑制STZ诱导的糖尿病小鼠神经节细胞的凋亡［14］。本研究通过检测STZ诱导的糖尿病大鼠视网膜细胞中Bcl⁃2及Bax蛋白强度，发现视网膜中的Bcl⁃2蛋白表达下降而Bax蛋白表达显著增多，Bcl⁃2/Bax的比值明显减小，与很多学者关于神经细胞凋亡的研究结果相似［15⁃16］，说明Bcl⁃2及Bax参与了实验性糖尿病大鼠视网膜神经细胞凋亡。而采用Res干预的糖尿病大鼠视网膜中Bcl⁃2蛋白表达增加，Bax蛋白表达减少，Bcl⁃2/Bax的比值升高，且与正常对照组大鼠视网膜Bcl⁃2 及 Bax表达相当，表明 Res可通过上调 Bcl⁃2的表达和下调Bax的表达，调整Bcl⁃2/Bax比值趋于正常化而发挥抗凋亡的作用。

综上所述，Res能减轻糖尿病大鼠视网膜的病理变化，并通过上调Bcl⁃2的表达及下调Bax的表达，提高Bcl⁃2/Bax比值，抑制视网膜神经节的细胞凋亡，从而延缓糖尿病视网膜病变的发生发展。本研究仅探讨了Res对Bcl⁃2和Bax的影响，Res是否能通过其他作用机制对DR起防治作用，将是今后的研究方向。

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