糖尿病心肌病患者内源性抗氧化体系及氧化应激水平

齐晓丹 常凌峰 于海涛 刘颖 高勇 林树东 闫晓光 许冬霞 张春晶

1齐齐哈尔医学院（161006黑龙江齐齐哈尔）；2齐齐哈尔医学院附属第三医院（161006黑龙江齐齐哈尔）；3齐齐哈尔市第一医院（161006黑龙江齐齐哈尔）

糖尿病患者长期处于高糖环境下，氧化应激增强，诱导心肌细胞凋亡和心肌功能降低，而引起糖尿病心肌病（diabetic cardiomyopathy，DCM）［1-2］，DCM发病率高，危害大，日益受到研究者的广泛关注［3］。DCM发病机制涉及糖脂代谢紊乱、胰岛素抵抗、氧化应激、心脏自主神经病变、心肌细胞凋亡等，其中心肌细胞氧化应激增强是DCM较早期的分子事件［4］。

糖尿病状态下氧化还原状态失衡，也会引起血液中一系列内源性抗氧化物质的改变，其中内源性抗氧化肽肌肽和谷胱甘肽系统是心肌细胞氧化还原体系的重要组成成分［5］，其会如何变化及程度如何未见报道。本研究探讨DCM患者血清中内源性肌肽、谷胱甘肽系统及氧化应激的水平，分析DCM患者内源性抗氧化体系——肌肽、谷胱甘肽系统与氧化应激之间的关系。阐明内源性抗氧化体系对糖尿病心肌病变保护作用的分子生物学机制，以期为DCM的防治提供一个新的思路和理论依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2014年6月至2016年9月齐齐哈尔医学院附属第三医院体检健康者（对照组）102例，男50例，女52例；2型糖尿病患者（DM组）96例，男49例，女47例；确诊DCM患者（DCM组）74例，男38例，女36例。纳入标准：（1）符合2013年中华医学会糖尿病学分会制定的DCM和T2DM 诊断标准［6］；（2）患者知情同意并签署知情同意书。所有患者均行空腹血糖（FPG）、餐后2 h血葡萄糖（2hPG）、血清总胆固醇（TC）、血清三酰甘油（TG）、低密度脂蛋白（LDL）、高密度脂蛋白（HDL）、胰岛素（FINs）、C肽、糖化血红蛋白（HbA1c）［7］等检测。

1.2 方法 采用酶联免疫吸附法（ELISA）测定血清人肌肽含量，微量酶标法测定总谷胱甘肽（T⁃GSH）、还原型谷胱甘肽（GSH）、氧化型谷胱甘肽（GSSG）水平，比色法测定GSH过氧化物酶（GSH⁃Px）和谷胱甘肽硫转移酶（GST）活性及谷胱甘肽还原酶活性系数（GRAC），硝酸还原酶法测定一氧化氮（NO）含量，钼酸显色法测定过氧化氢（H2O2）含量，比色法测定一氧化氮合成酶（NOS）和过氧化氢酶（CAT）活性，试剂盒购自南京建成生物有限公司。结果以美国BioTek Elx800多功能酶标仪测定吸光度值（A值）。

1.3 统计学方法 采用GraphPad Prism5软件进行数据分析。数据以均数±标准差表示，数据处理组间比较用F检验，两两比较用q检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般资料比较 各组之间资料进行比较分析，与对照组相比较，DM组、DCM组的例数、性别、TC、TG、LDL、HDL指标比较，差异无显著性（P＞0.05）。与对照组相比较，DM组、DCM组的BMI、FPG、2hPG、FINs、C肽、HbA1c等指标明显升高（P＜0.05），见表 1。

2.2 各组血清肌肽含量的变化 对照组血清肌肽平均值正常，DM组、DCM组平均值均低于正常。DM组与对照组相比有所降低，但差异无统计学意义（P＞0.05）。DCM组与对照组相比降低，差异有统计学意义（P＞0.05），DCM组与DM组相比较无显著变化（P＞0.05）。结果显示，DM和DCM时患者机体氧化应激增强，抗氧化肽消耗增加，血清中的抗氧化肽肌肽含量降低。见图1。

表1 各组一般资料对比分析Tab.1 Comparison analysis of clinical data among the groups x±s

图1 ELISA法检测人血清肌肽含量Fig.1 To detect human serum carnosine by ELISA method

2.3 各组血清谷胱甘肽系统水平测定 见表2。 结果显示，DM和DCM时机体谷胱甘肽系统异常，还原型GSH降低，氧化型GSSG升高，GSH/GSSG比值降低，GRAC及GST等活性降低，表明机体氧化水平增强，抗氧化能力减弱，氧化还原状态失衡。

2.4 各组氧化还原水平分析 与对照组相比较，DCM组NO含量较对照组显著升高（P＜0.01）；各组间TNOS活性差异无显著性；iNOS活性和H2O2含量DCM组有所升高（P＜0.05）；DM组和DCM组CAT活性均显著降低（P＜0.01），见图2。结果表明，DM和DCM时体内的氧化剂及自由基等增加，诱导氧化应激。

表2 各组人血清谷胱甘肽系统水平分析Tab.2 Glutathione system level analysis in human serum among each group ±s

表2 各组人血清谷胱甘肽系统水平分析Tab.2 Glutathione system level analysis in human serum among each group ±s

注：与对照组相比，*P＜0.05，#P＜0.01

T-GSH（μmol/L）GSH（μmol/L）GSSG（μmol/L）GSH/GSSG比值GSH-PX活力（μmol/L）GRAC GST活力（U/mL）T-SH（μmol/L）对照组45.1±2.3 15.6±0.9 14.0±0.8 1.16±0.06 177.8±7.3 19.2±1.1 32.2±1.8 522.6±25.1 DM组47.4±2.9 12.5±1.2 17.4±1.6 0.77±0.04#194.4±10.3 14.5±1.2 19.6±1.2#398.3±7.2*DCM组49.1±3.8 8.7±0.8*20.0±1.8*0.40±0.02#163.9±7.5 12.1±1.2*13.5±1.0#348.4±7.7#

图2 各组氧化还原水平分析Fig.2 Redox level analysis among each group

3 讨论

DCM的发生机制主要涉及以下几种因素:钙离子平衡紊乱、线粒体功能失调、代谢底物利用异常等［8］，而氧化应激增强是各因素的中心环节［9］。糖尿病状态下心肌细胞氧化应激损伤，可给予外源性抗氧化剂进行治疗，但是由于其本身的毒副作用，其疗效并不十分理想。因而，内源性抗氧化剂成为当今治疗及预防DCM的靶点，首先我们必须清楚糖尿病及DCM，患者体内这些内源性抗氧化剂水平是如何变化的，程度如何？

糖尿病状态下会引起一系列内源性抗氧化体系的改变，其中抗氧化肽是心肌细胞氧化应激体系的重要组成成分。生物体内的天然抗氧化肽主要为肌肽和谷胱甘肽。肌肽（carnosine）是一种天然的、具有高效生物活性的水溶性二肽，具有很强的抗氧化活性［10］，肌肽能够抑制生物体内整个过氧化链中的每一步氧化反应。然而，糖尿病和DCM患者血清肌肽水平如何？目前未见报道。刘亚丽等应用HPLC⁃UV分析心肌肌肉组织中内源性肌肽浓度，糖尿病大鼠组与正常大鼠组相比较显著降低［11］。本研究结果显示，DM和DCM患者血清肌肽水平降低，其中DCM组与对照组相比较，差异具有统计学意义（P＜0.05），结果表明DCM时抗氧化能力降低，氧化应激失衡。本研究结果与上述报道相一致，并进一步在DCM患者机体内进行证实。

谷胱甘肽系统是机体重要的抗氧化体系，在维持机体还原状态，防止自由基损伤等方面起着重要作用［12］。DM患者血清还原型谷胱甘肽（GSH）、GSH 过氧化物酶（GSH⁃Px）和谷胱甘肽还原酶（GR）的活性降低，而DCM患者血清谷胱甘肽系统相关指标的水平未见报道。本研究结果显示，DM和DCM时机体谷胱甘肽系统异常，T⁃GSH含量差异无显著性，还原型GSH降低，氧化型GSSG升高，GSH/GSSG比值降低，GRAC及GST等活性降低，表明机体氧化水平增强，抗氧化能力减弱，氧化还原状态失衡。

NO是内皮源性舒张因子，同时也是一种自由基，对心脏具有损伤与保护双重作用。一氧化氮合酶（NOS）有内皮型（eNOS）、诱导型（iNOS）和神经元型（nNOS）三种亚型，在心肌中均有表达，eNOS、nNOS合成的NO对心脏具有保护作用，iN⁃OS合成的NO对心脏具有损伤作用，是DCM及心肌细胞凋亡的重要诱导因子。本研究结果显示，NO含量DCM组较对照组显著升高，TNOS活性差异无显著性，iNOS活性DCM组较对照组显著升高。表明DCM时氧化应激增强，心肌细胞受到严重损伤。过氧化氢是一种活性氧，可被过氧化氢酶分解。本研究结果与以往报道相一致，DCM时氧化应激增强ROS生成增加，过氧化氢增加同时过氧化氢酶活性下降。

肌肽和谷胱甘肽是生物体内主要的天然抗氧化肽［13⁃15］，此外还有大量抗氧化蛋白如谷氧还蛋白、硫氧还蛋白等。谷胱甘肽是谷氧还蛋白的辅因子，维持谷氧还蛋白还原状态。氧化胁迫或能量缺失时GSH缺少、GSSG积累，可导致氧化态谷氧还蛋白1增加。本研究只检测了DM和DCM患者血清中肌肽和谷胱甘肽系统的变化，今后我们会进一步检测抗氧化蛋白的水平，并探讨这些内源性抗氧化剂之间的作用关系，为寻找高效的内源性抗氧化体系奠定理论基础。

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