老年肺癌患者组织HMGB1、MMP-9及VEGF-C的表达及临床意义

林国辉 王 燕 杨家盛 王 钧 陈 艳

(广东省第二人民医院呼吸内科，广东 广州 510317)

老年人是肺癌的高发群体，且多伴有多种基础疾病，治疗难度大且预后较差。肺癌的侵袭和转移是影响老年肺癌患者治疗和预后的重要因素，而肺癌侵袭、转移相关指标的监测，对患者的治疗和预后的评估均有重要的作用〔1～3〕。 高迁移率族蛋白(HMG)B1是一类非组蛋白染色体结合蛋白，主要存在于真核生物细胞内。释放到细胞外的HMGB1可参与细胞分化、增殖、迁移及炎性反应〔4,5〕。基质金属蛋白酶(MMP)是一类可以降解细胞外基质的金属蛋白酶，MMP-9是MMP家族中的一员，可降解Ⅳ型、Ⅴ型胶原和明胶，进而对肿瘤的侵袭和转移起到促进作用〔6〕。血管内皮生长因子(VEGF)-C是一种淋巴管生成因子，可诱导淋巴管和血管生成、生长〔7〕。本研究观察老年肺癌患者肺癌组织中HMGB1、MMP-9及VEGF-C的表达，进一步研究三种指标与肺癌的关系。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2015年3月至2017年6月期间广东省第二人民医院收治的老年肺癌患者92例，收集手术中切除的肺癌组织及其癌旁组织。纳入标准：①所有患者经临床病理检查确诊为肺癌；②经评估患者生存期>3个月；③初次诊断肺癌；④患者知情同意。排除标准：①接受过放化疗治疗者；②患有其他恶性肿瘤者；③存在肝、脑、肾等严重器质性疾病者；④临床资料不全者。92例肺癌患者中男52例，女性40例，年龄61～83岁，平均(68.65±4.63)岁；组织学类型：腺癌48例，鳞癌44例，有淋巴结转移42例，无淋巴结转移50例，分化程度：高分化27例，中分化36例，低分化29例。研究标本均在切除后立即处理，避免组织细胞的结构和成分发生变化，将其置于10%的中性甲醛溶液中固定，石蜡包埋后进行连续切片。本研究已通过医院伦理委员会的审批。

1.2免疫组化 取切片，烘烤60 min，采用二甲苯Ⅰ、Ⅱ脱蜡，梯度酒精水化(100%、95%、80%、70%)，自来水冲洗5 min，重复2次。滴加3%H2O2，避光孵育10 min，磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗3次，每次3 min。浸入枸橼酸钠缓冲液中，采用高压锅进行抗原热修复。山羊血清中封闭15 min。用滤纸吸去血清，滴加稀释好的一抗(HMGB1、MMP-9多克隆抗体购于北京博奥森生物试剂有限公司，VEGF-C多克隆抗体购于北京中杉金桥生物技术有限公司)，在4℃的环境下过夜处理，室温放置60 min，PBS冲洗2次，每次5 min，滴加生物素化的二抗，在37℃的环境下反应20 min，PBS冲洗2次，每次5 min，滴加链霉卵白素+辣根酶标记生物素试剂(SABC)，在37℃的环境下静置20 min，PBS冲洗2次，每次5 min。DAB显色，苏木素溶液复染10 min，盐酸酒精分化处理。梯度酒精(80%、95%、100%、100%)脱水处理，二甲苯Ⅰ、Ⅱ透明处理，滴加适量的中性树胶，封片晾干。

1.3结果判定 每个切片随机选取8个视野，在高倍镜(400倍)下观察，HMGB1、VEGF-C细胞核和细胞质呈现棕黄色为阳性，MMP-9细胞质呈现棕黄色为阳性。统计每个视野下HMGB1、VEGF-C阳性细胞数量，计算其阳性细胞率，并计算8个视野下的均值，阳性细胞率>20%为阳性表达。MMP-9阳性结合染色强度和阳性细胞率综合判断：阳性细胞率<10%为1分，10% ≤阳性细胞率<50%为2分，阳性细胞率≥50%为3分；染色强度无染色为0分，淡黄色为1分，黄色为2分，棕黄色记为3分；最后得分为阳性细胞率得分与染色强度得分的乘积，若总得分<3分则为阴性，总得分≥3分为阳性。

1.4统计学方法 应用SPSS22.0软件，计数资料进行χ2检验，采用Spearman相关系数进行相关分析。

2 结 果

2.1肺癌组织及癌旁组织中HMGB1、MMP-9及VEGF-C的表达比较 肺癌组织中的HMGB1、MMP-9及VEGF-C的阳性表达率〔59例(64.13%)，65例(70.65%)，62例(67.39%)〕均显著高于癌旁组织〔30例(32.61%)，28例(30.43%)，0例〕，差异有统计学意义(χ2=18.302,29.764,93.508;均P=0.000)。

2.2肺癌组织中HMGB1、MMP-9及VEGF-C的表达与临床病理特征的关系 肺癌组织中HMGB1、MMP-9及VEGF-C的表达与年龄、性别、分化程度无关(P>0.05)，有淋巴结转移、腺癌中的HMGB1、MMP-9及VEGF-C阳性表达率显著高于无淋巴结转移、鳞癌(P<0.05)。见表1。

表1 肺癌组织中HMGB1、MMP-9及VEGF-C的表达与临床病理特征的关系〔n(%)〕

2.3肺癌组织中HMGB1、MMP-9及VEGF-C表达的相关性分析 肺癌组织中HMGB1与MMP-9、VEGF-C呈正相关(r=0.452，0.423；P=0.005，0.007)，MMP-9与VEGF-C呈正相关(r=0.417，P=0.008)。

3 讨 论

相关研究结果显示，2015年我国的肺癌新增病例数为733.3千人，死亡病例数为610.2千人，且随着我国工业化的进展，环境不断恶化，吸烟人数不断上升，导致近年来肺癌的发病率呈递增的趋势〔8，9〕。肺癌患者普遍预后较差，苏靖等〔10〕对732例肺癌患者的生存时间进行分析，结果显示患者的1年生存率为60.11%，2年生存率为46.99%，而3年生存率仅为39.89%。肺癌患者在早期症状常较轻微，当疾病发展到一定程度时才感到身体出现明显的不适，但此时已错过最佳治疗时机，影响患者的治疗和预后。另一方面，肺癌易发生侵袭和转移，使其难以治愈，肺癌的远处转移是导致患者死亡的重要原因之一〔11，12〕。癌细胞具有生命力强、增殖能力强的特点，且与其他细胞接触时无接触抑制现象，这为其远处转移提供基础条件，但除此之外，细胞外基质与新生血管也与癌细胞的转移密切相关。

HMGB1是一种与肿瘤的发生、发展有密切关系的染色质蛋白，可提高组织纤溶酶原激活物的活性，提升肿瘤细胞的侵袭能力〔13〕；另一方面，HMGB1与其配体糖基化终产物受体结合后可激活p38、JNK、p42/p44等信号通路，进而激活MMP-2、MMP-9等多种MMPs，促进细胞外基质降解，利于肿瘤发生侵袭和转移〔14〕。MMP-9被激活后可降解细胞外基质的主要成分Ⅳ型胶原，破坏细胞外基质，导致肿瘤细胞向周围组织浸润，同时MMP-9可促进肿瘤内毛细血管的生长发育，为肿瘤的生长、转移提供基础〔15〕。研究显示〔16〕，MMP-9在肺癌、胃癌、肝癌、乳腺癌等多种恶性肿瘤中呈现高表达，是评估肿瘤侵袭、转移的重要指标之一。VEGF-C在正常情况下仅在消化道黏膜及呼吸道的内分泌细胞中呈现低表达，但当肺癌、胃癌、前列腺癌等恶性肿瘤发生时，其在肿瘤组织中呈现高表达〔17〕。VEGF-C通过与其受体血管内皮生长因子受体(VEGFR)-2结合，可促进血管内皮细胞迁移和增生，增加血管通透性，VEGF-C与其另一受体VEGFR-3结合后，可诱导VEGFR-3酪氨酸激酶磷酸化，导致淋巴管增生或扩张〔18〕。因此，VEGF-C是一种能促进淋巴管和血管生成、生长的因子，为肿瘤的生长发育提供氧气及营养，进而对其侵袭和转移起到促进的作用。本研究提示肺癌组织中的HMGB1、MMP-9及VEGF-C表达与有无淋巴结转移和组织学类型有关。腺癌的侵袭、转移现象一般较鳞癌严重，因此HMGB1、MMP-9及VEGF-C的表达也更高，同时也提示可通过检测HMGB1、MMP-9及VEGF-C水平来甄别腺癌和鳞癌。另外，本研究还显示，HMGB1与MMP-9、VEGF-C存在一定的内在联系，但其具体机制还有待进一步的研究。

4 参考文献

1Hjelmborg J,Korhonen T,Holst K,etal.Lung cancer,genetic predisposition and smoking:the Nordic Twin Study of Cancer〔J〕.Thorax,2017;72(11):1021-7.

2张亚男,赵宗兴,张亚坤,等.血清肿瘤标记物在肺癌诊断中的意义〔J〕.中国实验诊断学,2014;18(2):219-22.

3Oncel M,Sunam GS,Yildiran H.Video-assisted thoracoscopic lobectomy for lung cancer〔J〕.Ann Thorac Surg,2017;104(5):1760.

4Liu P L,Liu W L,Chang J M,etal.MicroRNA-200c inhibits epithelial-mesenchymal transition,invasion,and migration of lung cancer by targeting HMGB1〔J〕.PLoS One,2017;12(7):e0180844.

5张晓丽,于金明,朱 慧,等.非小细胞肺癌组织HMGB1表达临床意义Meta分析〔J〕.中华肿瘤防治杂志,2017;24(9):630-6.

6Pei J,Lou Y,Zhong R,etal.MMP9 activation triggered by epidermal growth factor induced FoxO1 nuclear exclusion in non-small cell lung cancer〔J〕.Tumour Biol,2014;35(7):6673-8.

7吕福有.血管内皮生长因子-A与血管内皮生长因子-C在非小细胞肺癌中表达及与淋巴结转移的相关性〔J〕.国际免疫学杂志,2017;40(3):263-7.

8苏建华,车国卫.肺癌患者术前肺功能评定的现状与进展〔J〕.中国肿瘤临床,2017;44(7):301-5.

9Chen W,Zheng R,Baade PD,etal.Cancer statistics in China,2015〔J〕.Ca A Cancer J Clin,2016;66(2):115.

10苏 靖,周正元,张 宁,等.常熟市肺癌患者的生存分析〔J〕.预防医学情报杂志,2015;31(4):315-7.

11秦 虹,张科乾,李文花,等.非小细胞肺癌脑转移全脑放疗联合靶向药物治疗系统评价〔J〕.中华肿瘤防治杂志,2015;22(4):300-4.

12Kim SW,Kyung Lee Y,Yeon Lee J,etal.PEGylated anticancer-carbon nanotubes complex targeting mitochondria of lung cancer cells〔J〕.Nanotechnology,2017;28(46):465102.

13Liu Y,Hu X,Xia D,etal.MicroRNA-181b is downregulated in non-small cell lung cancer and inhibits cell motility by directly targeting HMGB1〔J〕.Oncol Lett,2016;12(5):4181-6.

14Zhu J,Luo J,Li Y,etal.HMGB1 induces human non-small cell lung cancer cell motility by activating integrin αvβ3/FAK through TLR4/NF-κB signaling pathway〔J〕.Biochem Biophys Res Commun,2016;480(4):522-7.

15高金芳,张 莉,黄 燕,等.肺癌患者血清中VEGF,TIMP-1和MMP-9水平变化及临床意义〔J〕.现代生物医学进展,2017;17(4):728-30,627.

16Pence S,Özbek E,Ozan Tiryakioglu N,etal.rs3918242 variant genotype frequency and increased TIMP-2 and MMP-9 expression are positively correlated with cancer invasion in urinary bladder cancer〔J〕.Cell Mol Biol(Noisy-le-grand),2017;63(9):46-52.

17秦跃红,王功朝,刘 滨,等.星形细胞肿瘤组织中 VEGF-A、VEGF-C 的表达变化及其与肿瘤血管生成的关系〔J〕.山东医药,2014;54(15):1-3.

18Park YG,Choi J,Jung HK,etal.Fluid shear stress regulates vascular remodeling via VEGFR-3 activation,although independently of its ligand,VEGF-C,in the uterus during pregnancy〔J〕.Int J Mol Med,2017;40(4):1210-6.