ApoCⅢ对动脉粥样硬化的影响及可能机制

高 艺 陈清光 阿布都卡地尔·阿不都拉 裴晓黎

(复旦大学附属华东医院心内科，上海 200000)

载脂蛋白(Apo)CⅢ是脂蛋白代谢中主要调节蛋白之一，可提高心血管疾病的发生风险。流行病学调查研究显示，在T-455、SSTI等突变基因人群中ApoCⅢ高表达，血浆三酰甘油(TG)水平增加，心血管疾病发生风险明显提升；而在R19x突变基因人群中ApoCⅢ低表达，血浆TG水平降低且高密度脂蛋白含量增加，冠心病发生风险降低〔1〕。ApoCⅢ作为一个独立的促动脉粥样硬化因子，过量表达可以导致高脂血症并且促进动脉粥样硬化的病变发展〔2〕。本研究探讨ApoCⅢ对动脉粥样硬化的影响及可能机制。

1 材料与方法

1.1动物与试剂 ApoCⅢ转基因小鼠与LDLR小鼠杂交得到双基因修饰小鼠。取10周龄雄性双基因修饰小鼠12只为实验组，LDLR小鼠12只为对照组，两组均先普通饲料喂养1个月后用高脂饲料常规喂养3个月，断髓处死后左心室注入固定液，取心脏和完整主动脉。主要试剂：8-前列腺素检测试剂盒、丙二醛(MDA)检测试剂盒、还原性谷胱甘肽检测试剂盒均购于南京信帆生物技术有限公司；活性氧(ROS)荧光探针-二氢乙啶购于威格拉斯生物技术(北京)有限公司；鼠源单克隆抗体还原型辅酶Ⅱ氧化酶(NOX)-4、葡萄糖调节蛋白(GRP)78单克隆抗体购于上海联硕生物科技有限公司；二抗购于上海恒斐生物科技有限公司。

1.2主动脉和流出道形态学检测 显微镜视野下纵向剖开主动脉，观察粥样硬化斑块沉积并进行油红O染色，扫描染色呈阳性的区域并进行形态学定量，计算阳性面积；制备主动脉流出道，油红O染色后计算粥样硬化斑块面积；选用平滑肌细胞特异性抗体SM22a染色和巨噬细胞特异性抗体MAC3染色观察硬化斑块分布情况。使用Leica Microsystems软件对斑块面积进行定量分析，用硬化斑块面积与主动脉全长的面积的比值进行表示。

1.3血浆脂质和氧化应激指标检测 两组小鼠分别于普通饲料喂养1个月及高脂喂养3个月时，禁食6 h，肝素抗凝尾部采血，4℃恒温5 000 r/min 离心10 min，分离血浆。酶法检测总胆固醇(TC)和TG水平；酶联免疫吸附法(ELISA)检测血浆脂质过氧化物8-异前列腺素水平；比色法检测MDA水平；酶法检测还原性谷胱甘肽水平。

1.4主动脉ROS检测 小鼠主动脉壁行ROS荧光探针-二氢乙啶染色，检测ROS含量水平。二氢乙啶可自由透过活的细胞膜进入细胞内部，被细胞中的ROS氧化后生产二氢乙啶，渗入主动脉壁染色体中显示红色荧光。根据荧光数量可判断ROS含量和变化。

1.5主动脉基因表达情况检测 高脂喂养3个月后，使用蛋白和mRNA提取试剂盒，分别提取两组小鼠主动脉总RNA和蛋白。RT-PCR检测参与氧化应激基因mRNA表达情况，包括：纤溶酶原激活物抑制物(PAI)-1、NOX、内皮型一氧化氮合酶(eNOS)、超氧化物歧化酶(SOD)、p67；参与内质网应激基因mRNA表达情况，包括：GRP78、X盒结合蛋白(XBP)-1、增强子结合蛋白同源蛋白(CHOP)。Western印迹检测氧化应激蛋白NOX-4和内质网应激蛋白GRP78的表达情况。

1.6统计学分析 应用SPSS15.0软件进行t检验。

2 结 果

2.1两组血浆中脂质水平比较 普通饲料喂养时实验组小鼠血浆TG(8.35±2.40)mmol/L，明显高于对照组〔(2.58±0.69)mmol/L，P<0.01〕；TC〔(10.91±2.23)mmol/L〕明显高于对照组〔(6.82±0.95)mmol/L，P<0.05〕。高脂喂养3个月后，实验组小鼠TG〔(6.63±2.47)mmol/L〕显著高于对照组〔(1.83±0.76)mmol/L，P<0.01〕。实验组和对照组TC〔(23.57±0.48)mmol/L〕、〔(21.66±2.20)mmol/L〕差异无统计学意义(P>0.05)。

2.2两组动脉粥样硬化情况比较 高脂喂养3个月后，两组主动脉全长染色均显示出动脉粥样硬化斑块，其中实验组主动脉流出道处硬化斑块更为明显(见图1)。实验组粥样硬化斑块面积〔(18.39±3.51)×104μm2〕明显大于对照组〔(9.61±1.95)×104μm2，P<0.05〕。实验组平滑肌细胞〔(11.26±2.85)×104μm2〕和巨噬细胞中硬化斑块面积〔(15.34±1.96)×104μm2〕均明显大于对照组〔(5.90±1.13)×104μm2、(8.65±2.07)×104μm2，P<0.05〕。见图2。

图2 两组流出道动脉粥样硬化病变情况(×40)

2.3两组氧化应激和主动脉ROS水平 实验组与对照组小鼠血浆脂质过氧化产物8-异前列腺素水平分别为(246.82±21.07)ng/L、(113.92±13.38)ng/L；MDA水平分别为(138.20±10.71)mol/L、(53.14±4.36)mol/L；还原性谷胱甘肽水平分别为(53.14±4.36)μmol/L、(138.20±10.71)μmol/L。实验组与对照组主动脉壁ROS水平分别为〔(19.07±3.65)×104μm2〕、〔(9.25±1.36)×104μm2〕，见图3。实验组8-前列腺素、MDA、ROS水平明显高于对照组，还原性谷胱甘肽水平明显低于对照组(P<0.05)。

2.4两组主动脉与内质网应激相关基因变化情况 实验组氧化应激相关基因PAI-1、NOX、eNOS、SOD、p67 mRNA相对表达量显著高于对照组，内质网应激相关基因GRP78、XBP-1、CHOP相对表达量显著高于对照组(P<0.05)。见表1。实验组与对照组氧化应激相关基因NOX-4蛋白的相对表达量分别为(56.39±3.75)、(28.61±1.68)，内质网应激相关基因GRP78蛋白的相对表达量分别为(94.62±16.18)、(42.95±11.35)；实验组NOX-4、GRP78蛋白表达量均显著高于对照组(P<0.05)。

图3 两组主动脉二氢乙啶染色情况(×40)

表1 两组主动脉与内质网应激相关基因mRNA表达水平

与对照组比较：1)P<0.05

3 讨 论

ApoCⅢ被认为血脂异常、内皮功能障碍、炎症和心血管疾病的共同关联分子，可作为预测冠心病的危险因素〔3〕。本研究结果证实，ApoCⅢ高表达可独立于血浆TC水平之外，对动脉粥样硬化过程起明显促进作用。研究发现，患者体内高氧化应激水平时，炎症因子和血浆ApoCⅢ也处于高水平〔4〕。8-异前列腺素水平主要由自由基诱发不饱和脂肪酸过氧化反应后分泌的小分子脂类物质，为前列腺异构体。MDA是体内活性氧与多不饱和脂肪酸产生氧化反应生成的终产物。还原性谷胱甘肽是由3个氨基酸共同构成的小分子肽，在体内发挥重要的抗氧化和清除自由基作用，将体内有害物质转出体外。Guettier等〔5〕认为，ApoCⅢ多态性位点能和脂肪酸结合蛋白2相互作用，从而导致代谢综合征的发生率增加。最新研究显示，代谢综合征患者机体中极低密度脂蛋白(VLDL)分泌量增加，血浆ApoCⅢ水平提升，用该类患者血浆分离出的VLDL可有效促进内皮细胞ROS生成，诱发内皮细胞凋亡〔6〕。NOX介导的氧化应激可影响内皮祖细胞正常功能，在多种心血管疾病发展中起重要作用。本研究提示ApoCⅢ高表达可激活NOX、PAI-1、eNOS、SOD、 p67表达水平，进而促进动脉粥样氧化斑块的形成。相关研究显示，氧化应激与内质网应激存在相关性〔7〕；一项对小鼠胰岛细胞研究显示，ApoCⅢ可提升高胰岛β细胞中钙离子水平并促进细胞凋亡，而细胞中钙离子浓度增加与内质网应激也存在相关性〔8〕。本研究提示ApoCⅢ高表达可激活GRP78、XBP-1、CHOP表达水平，促进内质网应激水平，诱发动脉粥样氧化斑块的形成。

4 参考文献

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