木犀草素对左旋多巴诱导异动症大鼠行为学的影响及其机制

杜望春 卢新刚 王 坚

(上海健康医学院临床医学院，上海 201318)

左旋多巴(LD)是目前治疗帕金森病(PD)最有效的药物，但在应用LD治疗的5～10年间，有70%～80%的患者会出现异动症(LID)，进而加重PD患者病情，严重地影响了其生活质量。如何科学合理地使用LD，通过联合用药协同发挥其最大的生物效应，改善运动并发症，提高患者生活质量是当前面临的重要课题〔1〕。LID机制复杂，可能主要与基底节的运动易化通路和运动抑制通路功能失衡有关〔2，3〕。尽管学术界对LID的临床前和临床研究进入了深入研究，但现在仍没有理想的药物能预防和延缓LID的发生并应用于临床。

木犀草素(LT)是一种天然多酚黄酮类成分，多以糖苷的形式存在于多种植物(如全叶青兰、野菊花、金银花等)中，药理研究显示其具有抗炎、抗氧化及神经保护等多种作用〔4～7〕。本研究以6-羟基多巴(6-OHDA)偏侧PD大鼠为模型，考察LT对LID大鼠行为学的影响及其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1实验动物 雄性SD大鼠，体质量200～250 g，SPF级，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供(许可证号：SCXK沪2007-0005)。

1.2药物和试剂 6-OHDA、阿扑吗啡(APO)、LD均购于美国 Sigma公司；苄丝肼、LT(≥98%)购于阿拉丁公司。兔抗大鼠神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)单克隆抗体、兔抗大鼠诱导型一氧化氮合酶(iNOS)购自艾博抗(上海)贸易有限公司；GADPH单克隆抗体购于碧云天生物技术研究所。肿瘤坏死因子(TNF)-α和白细胞介素(IL)-1β酶联免疫吸附实验(ELISA)试剂盒购自博士德生物科技有限公司。

1.3仪器 Elx800酶标仪(BioTek)，ChemiDocXRS化学发光成像系统(Bio-RAD)。

1.4方法

1.4.16-OHDA偏侧PD大鼠模型的建立和行为学评价 大鼠经12 h 以上禁食(不禁水)后称重，40 g/L水合氯醛(0.3 ml/100 g，灌胃)麻醉，按杨晓帆等〔8〕方法建模：将其以严格平颅位固定于大鼠脑立体定向仪上，常规消毒后，剪开头皮，剥离骨膜，用3%H2O2止血并充分暴露前囟。向右侧纹状体注射4 μg/μl的6-OHDA 4 μl，注射过程中分4点，并严格依据下列坐标：前囟前、中线旁开、颅骨下分别为1.2 mm和1.2 mm，2.5 mm和3.5 mm，4.5、6.5 mm和 4.5、6.5 mm。每点的注射速度和注射量均分别为1 μl/min和1 μl。完成注射留针5 min后以较慢的速度退出。常规消毒并缝合伤口，待大鼠清醒后送回动物房饲养。假手术组在相同位点注射含0.2%维生素(Vit)C的注射生理盐水，其余操作均与模型组相同。术后每天观察大鼠的自主行为变化：有无头偏斜、震颤、活动迟缓、少动、尾僵直、竖毛、抓握、嗅探等异常行为；2 w后腹腔注射APO(0.5 mg/kg)诱导其对侧旋转行为，10 min后记录30 min内旋转圈数，>平均7 转/min(总计≥210圈)的大鼠视为成功的PD大鼠。

1.4.2分组与给药 选择造模成功的PD大鼠，于APO诱导旋转行为2 d 后，随机分为LT组(10和30 mg/kg)、LID组和空白基质组，每组12只。首先分别每天1次腹腔注射LT空白基质、10和30 mg/kg LT，30 min后腹腔注射LD(10 mg/kg)和外周脱羧酶抑制剂苄丝肼(2.5 mg/kg)；空白基质组腹腔注射苄丝肼(2.5 mg/kg)，连续用药21 d。

1.4.3异常不自主运动评分(AIM) 参照Lee等〔9〕LID模型大鼠AIM评分表，分别于腹腔注射LD/苄丝肼后第1、5、9、13、17、21天进行评分，评定给药后120 min内AIM分数。每20 min评定1次，每次1 min，共6次。将AIM分为4个部分进行评定：①轴性AIM：头部及躯体朝向损毁侧的侧屈及轴性旋转；②上肢AIM：头部及躯体朝向损毁侧的侧屈及轴性旋转；③口面部AIM：重复性的吐舌及下颌咀嚼行为；④运动AIM：损毁对侧前肢重、节律性的反射运动或肌肉运动障碍。每部分又根据其有无和严重程度分5个等级(0～4)：0：无；1：偶尔出现；2：经常出现；3：持续存在，刺激使之停止；4：持续存在，刺激不使之停止。

1.4.4ELISA 法检测大鼠脑纹状体中TNF-α和IL-1β的含量 大鼠断头取脑后，在冰上分离出纹状体。按100 g/L的稀释比例，用组织匀浆器匀浆，将匀浆液在4℃，10 000 r/min的条件下离心20 min，收集上清。按照大鼠ELISA试剂盒操作说明测定脑纹状体匀浆液中炎症因子TNF-α和IL-1β的含量。

1.4.5Western印迹蛋白免疫印迹 大鼠断头取脑，迅速冰上剥离出纹状体，加入适量组织裂解液和苯甲基磺酰氟(PMSF)，超声裂解，提取总蛋白。用聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)蛋白浓度测定试剂盒测定白蛋白浓度后加入5倍十二烷基硫酸钠(SDS)上样缓冲液，入沸水煮5 min，冰上冷却，置-80 ℃冻存备用。80 μg蛋白样本进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)，电转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，用含5%脱脂奶粉室温封闭1 h，Tris盐酸缓冲液(TBST)洗膜，4℃过夜孵育一抗，二抗室温孵育1 h，TBST洗膜，电化学发光法(ECL)显色，置于暗室曝光显影，自动凝胶成像系统采集图像。

1.5统计学分析 采用SPSS17.0软件。组间差异采用单因素方差分析，组间两两比较用t检验。

2 结 果

2.1LT对LD诱导LID大鼠行为学的影响 接受慢性LD治疗的6-OHDA偏侧PD大鼠出现不自主运动，主要表现为躯干、肢体、头面部及行走等的异常运动。经LD治疗后，PD大鼠多在第2～3天出现症状，随治疗时间延长评分逐渐升高，2 w左右基本达到高峰。合用LT治疗后，能显著降低 LD 引起的轴性、上肢、口面部和运动的AIM值(P<0.05)，其中对上肢AIM值的影响最弱，见图1。LT 10、30 mg/kg治疗组间行为学特征差异无统计学意义(P>0.05)。

2.2LT对LID大鼠纹状体匀浆中TNF-α和IL-1β水平的影响 LID组纹状体中TNF-α和IL-1β表达较空白基质组显著增高(P<0.05)。LT 10、30 mg/kg组的大鼠纹状体匀浆中TNF-α和IL-1β水平较LID组和空白基质组显著下降(P<0.05)，且与LT10 mg/kg组相比，30 mg/kg组更能显著地降低TNF-α和IL-1β水平(P<0.05)。见表1。

2.3Western印迹检测GFAP和iNOS蛋白的表达水平 LID组GFAP和iNOS蛋白表达与空白基质组相比有明显升高(P<0.05)。LT 10和30 mg/kg组大鼠纹状体中GFAP和iNOS蛋白表达与 LID组和空白基质组相比有显著下降(P<0.05)，且呈剂量依赖性，见图2。

与LID组相比：1)P<0.05图1 LT对LID模型大鼠AIM值的影响

表1 LT对纹状体组织匀浆中 TNF-α和IL-1β水平的影响

与LID组相比：1)P<0.05；与空白基质组相比：2)P<0.05；与LT 10 mg/kg组相比：3)P<0.05

图2 LT对LID模型大鼠纹状体中GFAP和iNOS表达的影响

3 讨 论

神经免疫炎症和小胶质细胞的激活在多巴胺能神经元变性甚至死亡中发挥着重要作用。体外细胞培养证实，激活的小胶质细胞和星状细胞通过产生氧自由基、活性氧(ROS)、一氧化氮(NO)、前列腺素(PG)E或细胞因子如TNF-α、IL-1、IL-6等引起脑内炎症反应，进而加剧小胶质细胞的活化，分泌的炎性物质在脑内积聚导致神经毒性，继而导致神经元死亡〔1～3〕。对PD患者进行病理解剖时发现，在中脑变性的黑质细胞周围有大量激活的小胶质细胞，而且激活的小胶质细胞的数目与脑内多巴胺能神经元变性的范围密切相关〔10〕。

体内外研究表明金刚烷胺(ATD)能抑制激活的核因子(NF)-κB信号通路，减少炎性细胞因子如TNF-α等释放和表达，从而抑制小胶质细胞的活化〔11〕。Barnum等〔12〕给予6-OHDA损伤大鼠腹腔内注射内源性抗炎药皮质酮和纹状体内注射IL-1受体阻断剂，能降低模型大鼠LID引起的AIM值，表明神经炎症可能参与LID的发病机制。Bortolanza等〔13〕研究发现LID模型大鼠小胶质细胞标志物GFAP和OX-12的表达有显著性增加，选择性一氧化氮合酶(NOS)抑制剂7-硝基吲唑(7-NI)30 mg·kg-1·d-1能改善LID大鼠的行为学特征，并能显著抑制GFAP和OX-12的表达，表明抑制小胶质细胞的活化、减少炎性因子的释放能改善LID的进展。

LT是一种天然四羟基黄酮化合物，能显著抑制LPS诱导大鼠脑原代混合细胞和小胶质细胞产生 TNF-α、NO和超氧自由基，显著增加原代混合细胞对多巴胺的摄取，起到保护多巴胺能神经元的作用〔14〕。Zhu等〔5〕证实LT能显著抑制小胶质细胞活化引起的NF-κB、MAPK和Akt等信号级联反应，从而抑制炎性因子的释放，达到保护神经的作用。这显示LT能抑制中枢神经炎性反应，因此在治疗神经炎性相关中枢神经系统疾病有广阔的应用前景。本研究表明LT能显著改善PD模型大鼠的LID症状，减弱LID发生。机制研究结果显示，LT能显著抑制PD模型大鼠在接受LD治疗后诱发的小胶质细胞活化，降低TNF-α和IL-1β等炎性因子的释放，改善其行为学表现特征，从而发挥治疗LID的作用，但其明确的机制及与其他作用机制的相互关系有待进一步明确。

4 参考文献

1Calabresi P，Di Filippo M，Ghiglieri V，etal.Levodopa-induced dyskinesias in patients with Parkinson′s disease：filling the bench-to-bedside gap 〔J〕.Lancet Neurol，2010；9(11)：1106-17.

2王 蓉，欧阳敏，张 萍，等.帕金森病小鼠黑质纹状体小胶质细胞活化表达的炎性因子与多巴胺含量的关系〔J〕.中国老年学杂志，2014；34(10)：2768-70.

3Huot P，Johnston TH，Koprich JB，etal.The pharmacology of L-DOPA-induced dyskinesia in Parkinson′s disease 〔J〕.Pharmacol Rev，2013；65(1)：171-222.

4Xu J，Wang H，Lu X，etal.Posttraumatic administration of luteolin protects mice from traumatic brain injury：implication of autophagy and inflammation 〔J〕.Brain Res，2014；1582：237-46.

5Zhu L，Bi W，Lu D，etal.Luteolin inhibits SH-SY5Y cell apoptosis through suppression of the nuclear transcription factor-κB，mitogen-activated protein kinase and protein kinase B pathways in lipopolysaccharide-stimulated cocultured BV2 cells 〔J〕.Exp Ther Med，2014；7(5)：1065-70.

6Patil SP，Jain PD，Sancheti JS，etal.Neuroprotective and neurotrophic effects of Apigenin and Luteolin in MPTP induced parkinsonism in mice 〔J〕.Neuropharmacology，2014；86：192-202.

7刘雪飞.木犀草素对人乳腺癌细胞胰岛素样生长因子-1的影响〔J〕.中国老年学杂志，2014；34(14)：3967-9.

8杨晓帆，韩鹏飞，臧兆萍，等.人胶质细胞源性神经营养因子转染大鼠神经干细胞移植对老年帕金森病大鼠的作用〔J〕.中国老年学杂志，2015；35(22)：6339-41.

9Lee CS，Cenci MA，Schulzer M，etal.Embryonic ventral mesencephalic grafts improve levodopa-induced dyskinesia in a rat model of Parkinson′s disease 〔J〕.Brain，2000；123(Pt 7)：1365-79.

10Teismann P，Tieu K，Cohen O，etal.Pathogenic role of glial cells in Parkinson′s disease 〔J〕.Mov Disord，2003；18(2)：121-9.

11Kim JH，Lee HW，Hwang J，etal.Microglia-inhibiting activity of Parkinson′s disease drug amantadine 〔J〕.Neurobiol Aging，2012；33(9)：2145-59.

12Barnum CJ，Eskow KL，Dupre K，etal.Exogenous corticosterone reduces L-DOPA-induced dyskinesia in the hemi-parkinsonian rat：role for interleukin-1beta 〔J〕.Neuroscience，2008；156(1)：30-41.

13Bortolanza M，Cavalcanti-Kiwiatkoski R，Padovan-Neto FE，etal.Glial activation is associated with l-DOPA induced dyskinesia and blocked by a nitric oxide synthase inhibitor in a rat model of Parkinson′s disease 〔J〕.Neurobiol Dis，2014；73：377-87.

14王继双，何 焱，张文静，等.木犀草素的药理作用研究进展〔J〕.生命科学，2013；25(6)：560-5.