PI3K/AKT信号通路与骨肉瘤组织中脂肪酸合成酶过表达的相关性

2018-05-23 09:16仇海军
中国老年学杂志 2018年9期
关键词:印迹着色阳性细胞

仇海军 赵 醒

(承德县中医院外二科,河北 承德 067400)

骨肉瘤与许多肉瘤组织一样,容易发生血道转移,对骨肉瘤相关发病机制的研究仍是现代医学研究的热点。蛋白激酶B(AKT)〔1~3〕本质是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,AKT蛋白质生物结构含480个氨基酸,PH 结构域位于N端,调节活性区位于C端,催化活性区位于中间,是磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/AKT信号通路的重要信号分子,可以激活下游分子。该通路激活后,参与完成细胞的生长增殖,与多种肿瘤的发生发展有关。脂肪酸合成酶(FASN)〔4〕的主要生物学功能是从头合成长链饱和脂肪酸,机体主要靠饮食中摄取,故FASN的表达水平也较低,在多种肿瘤组织均发现FASN的表达上调。本研究探讨AKT和FASN与骨肉瘤发生发展的关系。

1 材料和方法

1.1材料来源 收集承德县中医院及承德医学院附属医院骨外科2000~2015年手术切除的30例骨肉瘤标本及骨巨细胞瘤标本,由有经验的病理科医生重新切片复诊确诊,石蜡标本4 μm用于免疫组化检测。同时收集上述新鲜组织,液氮保存,用于Western印迹检测。30例骨肉瘤标本中,男19例,女11例;病变位于胫骨上端12例,股骨下端9例,其他部位9例。全部病例经临床病史、X线和病理结合诊断。

1.2免疫组化法 实验步骤:石蜡切片常规脱蜡至水,热抗原修复,磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗3次,H2O2溶液消除内源性过氧化物酶的活性,5 μl 10% 山羊血清封闭,滴加一抗,室温孵育2 h。其后PBS冲洗3次,每次5 min。分别滴加生物素标记二抗,孵育30 min,其后 PBS 冲洗3 次,每次5 min,二氨基联苯胺(DAB)溶液显色,苏木素复染细胞核5~10 s后,分化,反蓝,常规脱水、透明、封片。染色时设立阴性对照(以PBS代替Ⅰ抗)和阳性对照(由试剂公司提供)。一抗为兔抗人单克隆抗体,购自北京中杉金桥生物技术有限公司。SP试剂盒、DAB显色剂均购自福建迈新技术有限公司。判断标准:以细胞核或细胞质出现背景清晰的黄色或棕黄色颗粒为阳性。分为强着色(>95%阳性细胞),中等着色(51%~95%阳性细胞),弱着色(2%~50%阳性细胞),表达缺失(<2%阳性细胞)〔5〕,本实验中把弱着色与表达缺失视为阴性表达,强着色与中等着色视为阳性表达。

1.3Western印迹检测 将新鲜组织于冷PBS中洗净血液,剪碎,加入RIPA裂解液,测定提取液的蛋白含量。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳,半干转膜,转膜完毕于室温封闭2 h置于含5%脱脂奶粉的TTBS,一抗结合,4℃过夜,洗膜,每次10 min,共3次,二抗结合,化学发光法检测。

1.4统计学方法 采用SPSS18.0统计软件包进行χ2检验、相关性分析采用直线相关分析。

2 结 果

2.1免疫组化法检测AKT、FASN在骨肉瘤与骨巨细胞瘤中的表达 FASN蛋白染色阳性物位于细胞质中,AKT的阳性部位位于细胞核和细胞质,均呈深浅不一的棕黄色颗粒。AKT在骨肉瘤中的阳性表达率为70%(21/30),显著高于骨巨细胞瘤中的表达〔26.66%(8/30)〕,差异有统计学意义(P=0.02)。FASN在骨肉瘤中的阳性表达率为56.67%(17/30),显著高于骨巨细胞瘤中的表达〔20%(6/30)〕,差异有统计学意义(P=0.03)。

2.2Western印迹法检测AKT、FASN在骨肉瘤与骨巨细胞瘤中的表达 AKT在骨肉瘤组织中的相对表达量为0.861±0.072,显著高于骨巨细胞瘤组织中的表达(0.127±0.008),差异有统计学意义(P<0.05),FASN在骨肉瘤中的相对表达量为0.827±0.059,显著高于骨巨细胞瘤组织中的表达(0.218±0.012),差异有统计学意义(P<0.05)。见图1。

1,2:骨肉瘤;骨巨细胞瘤图1 Western印迹法检测AKT,FASN

2.3AKT、FASN与骨肉瘤临床病理特征的关系 Western印迹结果显示,AKT在骨肉瘤中的表达与患者性别、发生部位均无关,与软组织浸润及远处转移有关(P<0.05)。FASN在骨肉瘤中的表达与患者年龄、性别、发生部位均无关,有远处转移者表达有升高趋势,但差异无统计学意义(P>0.05),与软组织浸润有关(P<0.05),见表1。

表1 AKT、FASN阳性表达骨肉临床病理特征关系

2.4AKT、FASN在骨肉瘤中的相关性 AKT、FASN蛋白在骨肉瘤中的表达呈正相关(r=0.81,P<0.01)。

3 讨 论

研究表明在多种肿瘤组织中,均发现FASN的表达上调〔6~8〕,龙新华等〔9〕认为FASN高表达在骨肉瘤转移中扮演重要的角色,并进一步研究提示,miR-424很可能通过靶向调控FASN基因影响骨肉瘤细胞侵袭和转移。刘志礼等〔10〕也应用免疫组织化学SP方法,检测60例骨肉瘤组织中FASN蛋白表达情况,以21例骨软骨瘤组织作为对照,也提示FASN蛋白在骨肉瘤组织中呈高表达,与骨肉瘤的发生及远处转移密切相关。P13K/AKT信号通路是研究较多的肿瘤相关信号通路〔11,12〕,在多种肿瘤组织中均发现过度激活,AKT是该通路的关键酶之一,其活化依赖于上游分子PI3K的激活,激活后,AKT磷酸化,变成p-AKT活化形式,进而在细胞质或细胞核对其下游蛋白发挥激活或抑制作用,最终参与细胞生长和增殖、细胞代谢、蛋白质合成等多种生物学功能。彭雅亚〔13〕发现乳腺癌中AKT表达增高与乳腺癌的浸润和侵袭转移有关,卵巢癌中也有类似发现〔14〕。本文结果显示AKT的表达与软组织浸润及转移密切相关,FASN的表达与软组织浸润相关,且均在骨肉瘤中表达上调,提示两种基因可能与骨肉瘤的发生发展有关。其可能机制为FASN表达上调能够通过降低对DDIT4de抑制作用,而使mTOR表达上调,mTOR是P13K/AKT信号通路的重要下游分子〔15〕。

4 参考文献

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9龙新华,刘志礼,刘家明,等.靶向调控FASN的miRNAs在不同侵袭力骨肉瘤细胞中的表达〔J〕.重庆医学,2015;44(1):7-13.

10刘志礼,罗庆丰,黄山虎,等.FASN 和p97 在骨肉瘤组织中的表达及其与骨肉瘤远处转移的关系〔J〕.实用癌症杂志,2010;25(6):591-4.

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13彭雅亚.在乳腺良恶性病变中的表达及其临床意义〔J〕.长沙医学院学报,2014;12(3):19-22.

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