沉默MMP-13对皮肤基底细胞癌细胞侵袭、迁移及Wnt信号通路的影响

周忠志 黄新灵 杨双喜 兰宏伟

(湖南中医药大学第一附属医院烧伤整形科，湖南 长沙 410007)

皮肤基底细胞癌(BCC)是常见的皮肤恶性肿瘤之一，占所有皮肤恶性肿瘤的65%～75%，早期表现为细小的半透明样局部隆起病变，后期症状多样化，容易漏诊和误诊〔1，2〕。BCC肿瘤细胞侵袭能力强，严重破坏深部组织〔3〕。基质金属蛋白酶(MMP)-13参与降解细胞外基质和多种肿瘤细胞的迁移、侵袭等过程〔4〕。MMP-13在非小细胞肺癌〔4〕、乳腺癌〔5〕、肝癌〔6〕等多种肿瘤组织中表达量升高，提示MMP-13升高与肿瘤的发生、发展有重要联系。本研究探讨RNA干扰抑制MMP-13的表达对BCC癌细胞侵袭、迁移能力的影响及作用机制。

1 材料与方法

1.1实验材料 人BCC A431细胞系由湖南中医药大学实验室保存，胎牛血清、DMEM培养基、Lipofectamine2000转染试剂盒购自美国Invitrogen公司，Transwell试剂盒购自BD Bioscience公司，蛋白提取试剂盒购自上海碧云天公司，MMP-13抗体购自Calbiochem公司，上皮细胞钙黏蛋白(E-cadherin)抗体、细胞周期蛋白(Cyclin)D1抗体、β-链蛋白(catenin)抗体、β-actin等抗体、羊抗鼠二抗购自美国abcam公司。

1.2细胞培养 A431细胞培养于含有10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 μg/ml链霉素的DMEM高糖培养基中，培养条件为37℃、5% CO2，每天观察细胞生长状态，0.25%胰酶消化收集细胞进行传代，及时更换新鲜培养基，生长状态良好的对数期细胞用于后期实验。

1.3细胞转染 取对数期细胞，胰酶消化成单细胞悬液，以1×106/孔接种至6孔板中，置于37℃、5% CO2恒温培养箱中培养24 h，与转染前1 h更换为不含抗生素的新鲜培养基。待细胞融合度约为80%时按照转染试剂说明书进行转染，转染后每天观察细胞状态。实验分为3组，对照组：不做任何处理的细胞，加入等量的Lipofectamine2000；MMP-13组：加入Lipofectamine2000和pLightSwith-MMP13-NC；MMP13-siRNA组：Lipofectamine2000和pLightSwith-MMP13-siRNA。各组细胞置于37℃、5% CO2的培养箱中培养6 h后更换含10%胎牛血清和青霉素、链霉素的培养基培养48 h，Western印迹检测转染效果。

1.4Transwell实验检测细胞的侵袭、迁移能力 实验前将提前配置好的Matrigel胶包被在Transwell小室基底膜上室，置于24孔板上，37℃孵育2 h。将转染后48 h的各组细胞用不含血清的培养基重悬，以1×103/孔接种于小室上室，下室中加入600 μl 10%胎牛血清的培养基作为趋化因子，待细胞侵袭24 h后，取出小室，弃去培养液，95%乙醇固定15 min，5%结晶紫染色15 min，磷酸盐缓冲液(PBS)清洗3次，用棉签轻轻拭去Matrigel胶和上室中未穿出的细胞，在倒置显微镜下取上、下、左、右、中5个视野计数，取平均数表示细胞侵袭、迁移力，每组3个复孔。迁移实验上室不包被Matrigel胶，其余步骤与侵袭实验相同。

1.5Western印迹检测转染细胞中β-catenin、CyclinD1、E-cadherin蛋白表达量 取各组转染后48 h的细胞，PBS洗涤，加入RIPA裂解液，10 000 r/min，4℃离心10 min，保留上清液，利用二喹啉甲酸(BCA)法测定蛋白的浓度，取30 μg蛋白煮沸变性5 min，使用8%～15%的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)胶进行电泳，待溴酚蓝到达胶的底部，终止电泳。将凝胶转入聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，Tris缓冲盐水-吐温(TBST)缓冲液清洗后，5%的脱脂奶粉室温封闭2 h，加入牛奶封闭液稀释的一抗，室温下孵育2 h，TBST清洗3次，每次10 min，加入二抗，室温避光孵育1 h，TBST清洗3次，每次10 min。通过电化学发光(ECL)蛋白印迹检测系统进行检测，以目的条带灰度值与内参β-actin灰度值的比值为各目的蛋白的相对表达量。

1.6统计学方法 使用SPSS22.0软件进行单因素方差分析、t检验。

2 结 果

2.1各组MMP-13蛋白表达量、细胞迁移、侵袭数比较 与对照组比较，MMP-13组MMP-13蛋白表达量、细胞迁移、侵袭数差异均无统计学意义(P>0.05)；MMP-13-siRNA组MMP-13蛋白表达量、细胞迁移、侵袭数均显著低于对照组及MMP-13组(均P<0.05)。见图1、表1。

2.2各组β-catenin、CyclinD1、E-cadherin蛋白表达量比较 与对照组相比，MMP-13组β-catenin、CyclinD1、E-cadherin蛋白表达量差异均无统计学意义(P>0.05)；MMP-13-siRNA组β-catenin、CyclinD1蛋白表达量显著低于对照组及MMP-13组(P<0.05)，E-cadherin蛋白表达量显著高于对照组及MMP-13组(P<0.05)。见表2、图2。

图1 各组MMP-13的表达量

表1 各组MMP-13蛋白表达量、细胞迁移、侵袭数比较

与MMP-13-siRNA组比较：1)P<0.05；下表同

图2 各组β-catenin、CyclinD1、E-cadherin蛋白表达情况

表2 各组β-catenin、CyclinD1、E-cadherin蛋白表达量比较

3 讨 论

BCC常发生于面部、颈部、四肢的皮肤表层或附属器，少见于躯干。研究认为，BCC由太阳辐射、电离辐射、放疗、局部慢性炎症等高危因素引起〔7〕，但发生发展机制尚不清楚，治疗目前多采用手术切除、放疗、局部用药或光动力疗法，但手术和放疗治疗复发率较高〔8〕。肿瘤恶化和复发多是因为局部肿瘤细胞发生浸润和远端转移。MMPs在降解细胞外基质和血管基底膜的过程中发挥重要作用，同时调节多种肿瘤细胞侵袭、迁移过程〔9〕。研究证明，S100A4可通过调节下游信号通路的靶基因MMPs增强肿瘤细胞侵袭、迁移能力〔10～12〕。MMP-13属于MMPs家族成员之一，对肿瘤细胞的转移浸润过程起重要调节作用。研究结果显示，MMP-13的表达量下降可抑制肿瘤细胞侵袭、转移〔13,14〕。为阐明MMP-13对皮肤基底细胞癌细胞侵袭、迁移的影响，本研究结果提示MMP-13参与了基底细胞癌细胞的侵袭、迁移过程。原癌基因int1与果蝇无翅基因wingless具有同源性，合称为Wnt。研究发现，Wnt信号通路调节某些正常的生理过程和诱导多种肿瘤的发生、发展〔15〕。Wnt/β-catenin通路是Wnt信号通路的经典途径。β-catenin是Wnt/β-catenin通路的核心作用因子，其在细胞质的含量升高并逐渐向核内转移是该通路的标志。Wnt蛋白可降低β-catenin复合物的稳定性，妨碍β-catenin磷酸化降解，从而引起β-catenin在细胞质中积累，转入细胞核中激活Wnt/β-catenin信号通路，增强下游靶基因的表达〔16〕。E-cadherin是Wnt信号通路的重要调节因子，主要影响β-catenin的活化。在细胞质中，β-catenin可与E-cadherin结合形成黏附性连接，若阻碍β-catenin与E-cadherin形成黏附连接，能够影响细胞质中β-catenin的磷酸化水平，从而影响Wnt信号通路发挥作用〔17〕。研究表明，当E-cadherin的表达量下降会降低细胞间的黏附力，导致肿瘤细胞侵袭、转移能力增强〔18〕。CyclinD1是Wnt信号通路的下游靶基因，调控细胞周期和肿瘤的发生、发展。当胞质内β-catenin积累量较多时，细胞膜的通透性增强，β-catenin进入细胞核，激活靶基因CyclinD1的表达，诱导肿瘤的发生、发展〔19〕。研究显示，CyclinD1表达量升高可调节乳腺癌细胞侵袭、迁移能力〔20〕。本研究提示MMP-13可能通过抑制Wnt信号通路的激活从而降低细胞侵袭、迁移能力，抑制肿瘤恶化。

综上，RNA干扰基底细胞癌细胞中的MMP-13的表达可抑制细胞的迁移、侵袭能力，其作用机制可能是通过影响Wnt信号通路的活性发挥作用。

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