醛固酮受体拮抗剂联合贝那普利对阿霉素肾病大鼠肾组织nephrin、WT1表达的影响

史亚男 王利军 胡志娟 冯 珍 牛 凯

(河北省人民医院肾内科,河北 石家庄 050051)

肾素-血管紧张素系统(RAS)与肾脏疾病联系密切。对于RAS的有效抑制是肾脏疾病治疗的重要途径。目前已证实血管紧张素转化酶抑制剂(ACEI)可降低肾病患者尿蛋白水平，延缓肾脏疾病进展，但长期应用，部分患者会发生醛固酮逃逸现象，且ACEI并不能完全阻断肾素-血管紧张素-醛固酮系统。微小病变肾病是肾病综合征常见病理类型，部分患者存在反复复发、激素依赖及激素抵抗等情况，临床表现为难治性肾病。阿霉素肾病大鼠肾脏病理改变与微小病变相似，均主要表现为肾小球上皮细胞足突融合。本实验观察阿霉素肾病大鼠肾组织nephrin和WT1表达变化，探讨醛固酮受体拮抗剂及贝那普利对其影响及nephrin和WT1与尿蛋白的关系。

1 材料与方法

1.1实验分组、动物模型建立及肾组织取材 体重200～220 g的雄性SD大鼠60只(河北实验动物研究中心提供)，分为正常对照(A组)、阿霉素肾病(B组)、贝那普利干预(C组)及醛固酮受体拮抗剂联合贝那普利干预(D组)各15只。B、C、D 3组一次性给予尾静脉注射阿霉素(10 mg/kg)，建立肾病模型；A组一次性给予尾静脉注射等量0.9%氯化钠；C组给予贝那普利10 mg·kg-1·d-1灌胃，1次/d；D组给予螺内酯40 mg·kg-1·d-1及贝那普利10 mg·kg-1·d-1灌胃，1次/d；A与B组仅给予等量自来水灌胃。建立模型第6周时所有大鼠测定24 h尿蛋白；腹主动脉取血，测定血清肌酐、白蛋白。部分肾组织甲醛固定后石蜡包埋；剩余肾组织以液氮冷冻后，-80℃保存。

1.2常规病理学观察 4%多聚甲醛固定肾组织，24 h后梯度乙醇脱水、二甲苯透明、浸蜡并石蜡包埋，切片厚2 μm，行苏木素-伊红(HE)、过碘酸雪夫染色(PAS)、肾组织六胺银染色(PASM)和Masson染色，光镜观察。每张切片在400倍物镜下至少取10个完整肾小球。戊二醛、锇酸双重固定肾组织后乙醇、丙酮梯度脱水，Epon812环氧树脂包埋后LKB-V超薄切片，并行铀-铅双重染色，最后JOEL-1200EX透射电镜观察并摄片。

1.3RT-PCR测定大鼠肾组织nephrin和WT1的表达 Trizol一步法提取组织总RNA，取5 μg组织总RNA进行逆转录合成cDNA，nephrin扩增片段长度371 bp。WT1扩增片段长度162 bp。β-actin扩增片段长度302 bp。nephrin上游引物5′GCCTGAGGTCCAGTGTGAGGA3′,下游引物5′TCATCCCCAGGCTTGGAACA3′;WT1上游引物5′TGTGTGCTTAAACTGCTTCCAA3′,下游引物5′TTAATCAAGAGTGGGCAGAGA-CC3′;β-actin上游引物5′TCCTCCCTGGAGAAGAGCTA3′,下游引物5′TCAGGAGGAGCAATGATCTTG3′。2%配制琼脂糖凝胶，并对扩增产物进行电泳，结果用BIO-PROFIL凝胶成像分析系统分析，nephrin及WT1 mRNA相对含量分别用与β-actin吸光度×面积的比值表示。

1.4统计学方法 应用SPSS21.0软件进行齐性检验、单因素方差分析、q检验。

2 结 果

2.1各组小鼠尿与血生化指标检测结果比较 与A组相比，B组白蛋白显著降低，血肌酐、24 h尿蛋白含量显著升高(均P<0.01)；与B组比较，C、D组白蛋白显著升高，血肌酐、24 h尿蛋白显著下降(均P<0.01)。见表1。

表1 各组白蛋白、血肌酐、24 h尿蛋白的比较

与A组比较：1)P<0.01；与B组比较：2)P<0.01

2.2病理组织学改变 光镜检查：与A组比较，B组大鼠肾组织出现包括部分肾小球局灶节段硬化、间质灶状纤维化及肾小管空泡颗粒样变性等改变。而C、D组上述肾脏病理改变明显改善，以D组效果明显。见图1。电镜检查：与A组比较，B组部分肾小球上皮细胞足突融合，间质灶状纤维化及肾小管空泡颗粒变性， C、D组变化较B组明显减轻。见图2。

图1 各组大鼠肾组织PAS染色结果(×200)

图2 各组大鼠肾组织电镜检查结果(×200)

2.3各组肾皮质nephrin和WT1表达水平比较 与A组相比，B组大鼠肾组织nephrin、WT1表达明显降低(P<0.01)；C组、D组nephrin、WT1 mRNA表达明显升高(P<0.05，P<0.01)。 见图3、表2。

图3 各组nephrin、WT1 mRNA表达的RT-PCR检测结果

表2 各组大鼠肾组织nephrin及WT1 mRNA相对半定量分析

与A组比较：1)P<0.01；与B组比较：2)P<0.05，3)P<0.01

3 讨 论

微小病变肾病临床发生率高，老年及儿童多发，临床表现为大量蛋白尿、低蛋白血症，可伴有肾功能受损。实验证实肾小球足细胞病变是导致肾病蛋白尿的重要因素〔1〕，研究表明足细胞所表达的足细胞相关分子对于维持足细胞正常结构和功能起重要作用〔2〕，其中nephrin是发现最早、研究最多，也是最重要的足细胞分子之一。已有实验证实编码nephrin分子的基因表达异常可见于多种尿蛋白排泄率增高的先天及后天获得性肾脏疾病。研究显示伴有蛋白尿的肾病患者肾组织nephrin表达水平下降〔3～5〕。WT1是一种抑癌基因，作用于足细胞特异性基因NPHS1，对维持正常的足细胞功能十分重要〔6〕。本研究显示，阿霉素肾病大鼠肾组织nephrin和WT1表达水平下降明显，推测其尿蛋白的发生与nephrin和WT1的表达改变有关。RAS激活在肾脏疾病中起重要的作用。研究表明，ACEI及醛固酮受体拮抗剂可降低肾病患者的尿蛋白水平，但具体机制不清〔7〕。本实验观察到阿霉素肾病大鼠应用贝那普利及醛固酮受体拮抗剂后，尿蛋白明显减少，同时肾组织nephrin和WT1表达增强，推测二者可能通过上调nephrin和WT1的表达，改善肾病大鼠肾小球足细胞的结构及功能，从而降低尿蛋白，二者作用协同。

4 参考文献

1Tesar V,Zima T,Kalousova M.Pathobiochemistry of nephrotic syndrome〔J〕.Adv Clin Chem，2003;37:173-218.

2Palmen T,Lehtonen S, Ora A,etal. Interaction of endogenous nephrin and CD2-associated protein in mouse epithelial M-1 cell line〔J〕. J Am Soc Nephrol,2002;13(7): 1766-72.

3Lahdenpera J,Kilpelainen P,Liu XL,etal. Clustering-induced tyrosine phosphorylation of nephrin by Src family kinases〔J〕. Kidney Int, 2003;64(4):404-13.

4Wang SX,Mene P,Holthofer H.Nephrin mRNA regulation by protein kinase C〔J〕.J Am Nephrol,2001;14(2):98-103.

5Huber TB,Kottgen M,Schilling B,etal.Interaction with podocin facilitates nephrin signaling〔J〕.J Biol Chem,2001;276(45): 41543-6.

6Srichai MB,Konieczkowski M,Padiyar A,etal.A WT1 co-regulator controls podocyte phonotype by shutting between adhesion structures and nucleus〔J〕.J Biol Chem,2004;279(14)：14398-408.

7Carey RM,Siragy HM.The intrarenal rennin-angiotensin system and diabetic nephropathy〔J〕.Trends Endocrinol Metab,2003;14(6):274-81.