Kruppel样因子8通过转化生长因子-β1介导的上皮间质转化促进胃癌细胞的侵袭转移

李天梁 徐 亮 李蜀华 冷 尉

(西南医科大学附属医院普外科，四川 泸州 646000)

转化生长因子(TGF)-β1是一类多功能细胞因子，参与了细胞分化、增殖、凋亡等生理过程，TGF-β1在多种病理过程中都大量表达，如慢性炎症疾病〔1〕和癌症〔2〕等。大量研究证实，在肿瘤微环境中，TGF-β1能够促进血管生成、细胞外基质沉积、增加蛋白水解酶合成等〔3～5〕。此外，TGF-β1还能够促进上皮间质转化(EMT)，EMT是促进肿瘤恶性进展的主要机制之一。肿瘤细胞发生EMT的典型特点是其上皮标志蛋白钙黏附蛋白E(E-cadherin)的表达降低和间质标志蛋白波形蛋白(Vimentin)表达增加。Kruppel样因子(KLF)8属于Kruppel样C2H2锌指转录因子家族成员之一，多种KLF家族成员被证实在肿瘤细胞中发挥着癌基因或者抑癌基因的功能，如KLF4、KLF5和KLF6。近来研究表明，KLF8在胃癌细胞中过量表达，并且在调节胃癌细胞增殖和侵袭中发挥着重要作用〔3〕，但是具体的机制并不清楚。已有研究证实KLF8与EMT之间存在联系〔4〕，并且KLF8是TGF-β1的下游转录因子之一，参与肿瘤的形成、进展和EMT等过程〔5〕。然而，关于KLF8在胃癌中的研究相对较少。本研究旨在探讨TGF-β1是否能够促进胃癌细胞发生EMT，并且KLF8是否参与了TGF-β1介导的EMT，从而促进细胞侵袭转移。

1 材料与方法

1.1细胞培养 人胃癌细胞株SGC7901和MKN45(中国上海科学院细胞库)，培养于RPMI1640培养基中(含10% 胎牛血清，10×104U/L青霉素，100 mg/L链霉素)，37℃，5%CO2条件下培养。TGF-β1处理组，即10 ng/ml TGF-β1，预处理胃癌细胞24 h，再进行后续实验。

1.2脂质体转染KLF8 siRNA 取4×105个处于对数生长期的MKN45细胞，接种于3.5 cm培养皿中，24 h后，采用脂质体Lipofectamine®3000(美国Invitrogen公司)将siKLF8(5′-CCGGCCCAGCACTGTTTAATGACATCTCGAGATGTCATTAAACAGTGCTGGGTTTTTG-3′)及siRNA无关序列(阴性对照组)(上海生工生物工程技术服务有限公司)转染至MKN45细胞中，操作步骤参照试剂说明书。实验分为空白对照(NC)组，siKLF8干扰组及阴性对照组

1.3荧光实时定量PCR(qRT-PCR) 收集各试验组细胞约1×105个，各细胞样品中加入1.0 ml Trizol(美国Thermo公司)，抽提细胞总RNA，按照RNA提取试剂盒(美国Invitrogen公司)的说明书操作。紫外分光光度计(美国Thermo公司)检测总RNA浓度及纯度(A260/A280)，逆转录试剂盒(大连宝生物工程有限公司)进行逆转录。KLF8、E-cadherin、Vimentin及内参甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)的qRT-PCR引物序列(上海生工生物工程股份有限公司)：KLF8正向5′-3′CTGCCTAATCTACCCAATCAGTTCA，反向5′-3′CTGGACAGTTGCTTATGGCATC；E-cadherin正向5′-3′GAGTGCCAACTGGACCATTCAGTA，反向5′-3′AGTCACCCACCTCTAAGGCCATC；Vimentin正向5′-3′CACCTCTAAGGCCATCACCAGCTAACCAACGA，反向5′-3′TCAAGGTCAAGACGTGCCAGA；GAPDH正向5′-3′TGGTGAAGACGCCAGTGGA，反向5′-3′CTGAGAACGCACCGTCAAGG。定量PCR扩增仪(ABI 7500，美国ABI公司)检测KLF8、E-cadherin、Vimentin表达水平。qRT-PCR扩增体系为10 μl，反应条件：50℃，2 min；95℃，10 min；95℃，15 s；60℃，1 min，进行35个循环。采用2-ΔΔCt方法表示各基因mRNA相对表达量，重复3次独立实验后进行统计分析。

1.4Western印迹试验 收集各试验组细胞(2～5)×105个，加入RIPA蛋白裂解液(上海碧云天生物技术有限公司)，抽提细胞全蛋白，二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量试剂盒(美国Thermo公司)检测蛋白浓度。10%十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离蛋白后，湿转法将蛋白转到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，5%脱脂奶粉室温振荡封闭1 h，Tris盐酸缓冲液(TBS-T)洗膜，鼠抗人KLF8单克隆抗体(sc-134375，美国Santa公司，1∶1 000稀释)，鼠抗人E-cadherin单克隆抗体(ab1416，美国Abcam公司，1∶1 000稀释)，鼠抗人Vimentin单克隆抗体(ab8978，美国Abcam公司，1∶1 000稀释)，兔抗人GAPDH单克隆抗体(sc-367714，美国Santa公司，1∶2 000稀释)，4℃孵育过夜。TBS-T洗膜后，加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠二抗(上海英基生物科技有限公司，1∶10 000稀释)，室温孵育1 h，加电化学发光法(ECL)发光液(美国Millipore公司)进行化学发光显影，凝胶成像仪(GelDoc-It，美国UVP公司)对蛋白条带进行观察，获取图像，并对图像进行灰度分析(Image Lab软件)，记录灰度值，计算目的蛋白与内参蛋白的灰度比值。重复3次独立试验后，进行统计分析。

1.5细胞划痕试验 取对数生长期细胞(5～7)×105个，接种于6孔板中，24 h后，细胞汇合度达90%以上；使用移液器枪头，垂直于6孔板底部，均匀划线，每孔3条平行线；磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤3次，去除漂浮的细胞，加入无血清RPMI1640培养基，37℃、5%CO2培养箱中正常培养，分别于0、24 h后显微镜(BX61，日本Olympus公司)下拍照，并计算细胞间距离。细胞间距离越大，说明迁移能力越低，重复3次独立试验后，进行统计分析。

1.6细胞侵袭试验 24孔板中放置Transwell小室，在小室上层加入4.0 μg/μl Matrigel基质胶50 μl，37℃，5%CO2培养箱中过夜，使Matrigel基质胶凝固；在24孔板下室中加入500 μl的含10%胎牛血清(FBS)的RPMI1640培养液，Transwell小室中加入100 μl的各试验组MKN45细胞悬液(细胞总数约1×105个)；48 h后，去除24孔板下室中的培养液，棉签擦去Transwell小室内室膜上的细胞，0.1%结晶紫溶液染色，室温5 min，显微镜(BX61，日本Olympus公司)下观察，每孔随机选取3个视野拍照，并记录每个视野的细胞数目。重复3次独立试验后，进行统计分析。

1.7高内涵细胞分析试验 处于对数生长期的MKN45细胞，接种于96孔板中，每孔5 000个细胞；24 h后弃去旧培养液，预冷PBS洗涤细胞2次，Heochst 33342对细胞进行荧光染色，15 min，预冷PBS洗涤2次，根据试验分组，对细胞进行不同处理后，采用高内涵药物筛选平台(Cellomics Array Scan VTI 1700 plus，美国Thermo公司)检测细胞72 h内的运动能力。重复3次独立试验后，进行统计分析。

1.8统计学方法 应用SPSS13.0软件，计量资料采用t检验；多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用LSD-t检验。

2 结 果

2.1TGF-β1促进胃癌细胞EMT Western印迹试验结果显示，在胃癌细胞SGC7901和MKN45中，与NC组〔E-cadherin:(1.00±0.01),(1.20±0.02);Uimentin:(0.99±0.03),(0.71±0.03)〕细胞相比，TGF-β1处理组细胞内的E-cadherin表达量(0.25±0.02，0.21±0.02)显著降低(t=44.126，52.679；均P=0.000)，而Vimentin的表达量(4.24±0.11，3.86±0.05)则显著增加(t=48.668，83.527；均P=0.000)，见图1A。本研究中，选择MKN45细胞进行后续试验。qRT-PCR结果显示，TGF-β1处理组MKN45细胞中，E-cadherin mRNA表达水平(0.22±0.01)显著低于NC组(1.01±0.01)，Vimentin mRNA表达水平(2.91±0.05)显著高于NC对照组(0.99±0.03)(t=73.314，50.325；均P=0.000)。经TGF-β1处理后，MKN45细胞形态发生了显著变化，见图1B。以上实验结果表明，TGF-β1能有效地减少上皮标志蛋白的表达，促进间质标志蛋白的表达，从而促进胃癌细胞EMT。

图1 胃癌细胞中E-cadherin和Vimentin的表达

2.2TGF-β1诱导KLF8表达 qRT-PCR和WB试验结果显示，与NC组(1.01±0.03，1.00±0.02)相比，TGF-β1处理组MKN45细胞内KLF8 mRNA(2.14±0.15)和蛋白(2.43±0.07)表达水平分别增加了2.1倍和2.4倍。以上试验结果表明，在胃癌细胞中，TGF-β1能够诱导KLF8的表达。

2.3TGF-β1通过KLF8信号通路调节E-cadherin和Vimentin表达 脂质体转染siKLF8，可降低MKN45细胞内KLF8的表达水平(NC组：1.02±0.02，阴性对照组：0.95±0.11，siKLF8干扰组：0.29±0.02；t=39.154，9.638，均P=0.000)。见图2A。在此基础上，检测siKLF8处理组MKN45细胞内的E-cadherin和Vimentin表达量，结果显示，siKLF8能够部分逆转TGF-β1的功能，导致E-cadherin表达上升，Vimentin表达下降，见图2B，表1。以上试验结果表明，TGF-β1能够通过KLF8信号通路调节E-cadherin和Vimentin表达。

(1)MKN45；(2)MKN45+TGF-β1;(3)NC;(4)NC+TGF-β1;(5)siKLF8;(6)siKLF8+TGF-β1图2 TGF-β1对各试验组MKN45细胞中E-cadherin和Vimentin表达的影响

表1 siKLF8对TGF-β1功能的逆转作用

2.4siKLF8逆转TGF-β1介导的促迁移和侵袭能力 细胞划痕试验显示，siKLF8处理组MKN45细胞的迁移能力比NC组和siKLF8阴性对照组明显降低，且TGF-β1处理后，能够显著促进NC组和siKLF8阴性对照组MKN45细胞的迁移能力，然而，TGF-β1(10 ng/ml，预处理24 h)对siKLF8处理组MKN45细胞的迁移能力，则无明显影响(P>0.05)。见图3A，表2。

Transwell侵袭试验结果显示，与NC组和siKLF8阴性对照组相比，siKLF8处理组MKN45细胞的侵袭能力显著降低；TGF-β1能够显著提高NC组和siKLF8阴性对照组的侵袭能力，但是TGF-β1对siKLF8处理组MKN45细胞的侵袭能力则无明显影响(P>0.05)。见图3B，表2。以上试验结果表明，KLF8在TGF-β1介导的胃癌细胞侵袭和转移中，发挥重要作用。

图3 siKLF8对TGF-β1诱导的迁移和侵袭能力的影响

表2 siKLF8对TGF-β1诱导的迁移、侵袭能力的影响

2.5TGF-β1通过KLF8促进细胞的运动能力 高内涵细胞分析试验结果显示，48 h及72 h时，siKLF8处理组MKN45细胞的运动速度比NC组和siKLF8阴性对照组明显下降；TGF-β1处理后，能够显著增加NC组和siKLF8阴性对照组运动速度，然而，TGF-β1对siKLF8处理组MKN45细胞的运动速度则无明显影响(P>0.05)。见表3。

表3 各试验组MKN45细胞的相对运动速度

与对应组的NC组和siKLF8阴性对照组比较：1)P<0.05；与对应的TGF-β1未处理组相比：2)P<0.05

3 讨 论

胃癌是全球最常见的恶性肿瘤之一，具有高侵袭性，易远处转移等特点，这也是导致胃癌患者治疗失败，不良预后甚至死亡的重要原因〔6，7〕。因此，寻找与肿瘤迁移侵袭相关的靶蛋白，阐明他们促进迁移侵袭的机制，是临床亟待解决的问题之一。胃癌细胞起源于腺上皮，具有上皮细胞的特征，但在某些因素的诱导下，胃癌细胞的上皮源性标志物E-cadherin表达下降，而间质性标志物Vimentin表达增加，使细胞从上皮细胞向间质细胞转化，即EMT〔8〕。研究证实，EMT能够促进肿瘤细胞的恶性进展〔9，10〕。TGF-β生长因子主要包括TGF-β1，TGF-2和TGF-β3，而TGF-β1在胃癌EMT过程中研究最为广泛，TGF-β1除了参与调控细胞增殖和免疫应答以外，在肿瘤的发生和发展过程中也发挥着双重作用，既能够诱导细胞凋亡、阻滞细胞周期，发挥抑制肿瘤的作用，又能够促进肿瘤细胞发生侵袭转移〔11，12〕。近年来的研究证实，KLF8是TGF-β1的下游因子，并且参与了细胞周期的调节，在肿瘤的形成和恶性进展中发挥着重要的作用。在多种肿瘤细胞中存在着KLF8的异常表达，如膀胱癌〔13〕、胰腺癌〔14〕、乳腺癌〔15，16〕等。

本研究表明TGF-β1刺激后，胃癌细胞中上皮标志蛋白的表达水平下降，而间质标志蛋白的表达水平增加，进而促进了胃癌细胞发生EMT。本研究也提示KLF8在TGF-β1诱导的一系列细胞变化中可能发挥作用。采用siKLF8干扰MKN45细胞内KLF8的表达后，能够部分逆转TGF-β1介导的降低E-cadherin、增加Vimentin表达，促进EMT的功能。本研究结果表明，TGF-β1能够增加细胞的迁移和侵袭能力，而在siKLF8组MKN45细胞中，TGF-β1并不能够促进细胞迁移和侵袭，即在胃癌细胞中，KLF8作为TGF-β1下游的效应分子，参与了TGF-β1介导的增强细胞迁移和侵袭的过程。

综上所述，TGF-β1能够诱导胃癌细胞发生EMT，并且TGF-β1能够诱导细胞内KLF8的表达；在胃癌细胞中，TGF-β1/KLF8信号通路激活后，细胞的迁移和侵袭能力显著增强；KLF8作为TGF-β1诱导EMT过程中的关键下游效应分子，在胃癌细胞的迁移和侵袭中发挥着极其重要的作用，TGF-β1/KLF8信号通路有可能作为逆转胃癌细胞EMT的作用靶标。

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