益坤宁对围绝经期大鼠卵巢雌激素受体、caspase-3及细胞凋亡率的影响

杜文霞

(河南省中医院 河南中医药大学第二附属医院妇产科，河南 郑州 450002)

围绝经期综合征是妇女在围绝经期由于雌激素分泌减少导致的一系列症状的症候群〔1～3〕，常用治疗方法为雌激素替代疗法，以缓解其围绝经期症状，疗效已得到肯定，但易增加子宫出血、子宫内膜癌、乳腺癌的发生率〔4，5〕。祖国中医认为发生围绝经期综合征的主要原因是肾虚、肝郁、脾虚。中药益坤宁是一种由多味中药材熬制而成的中药制剂，具有补肾、疏肝、健脾的功效，能显著改善围绝经期综合征的相关症状〔6〕。本研究拟探讨益坤宁对围绝经期大鼠卵巢雌激素受体(ER)、天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶(caspase)-3及细胞凋亡率的影响。

1 材料与方法

1.1实验动物 选取30只13～14月龄雌性Wistar大鼠，体重290～328 g，平均(311.4±11.7)g；另选取10只5月龄且有规律动情周期的雌性Wistar大鼠，体重176～209 g，平均(194.6±6.8)g。饲养环境温度20℃，湿度58%，每天给予12 h光照时间，自由饮食饮水。实验大鼠均由河南省中医院提供，合格证号：SYXK(豫)2016-0009。

1.2实验试剂与仪器 TUNEL试剂盒、二氨基联苯胺(DAB)显色液、Trizol试剂购自罗氏公司，蛋白酶K、3%H2O2、转化剂POD购自北京中杉金桥生物技术有限公司，caspase-3、ERα、ERβ抗体均购自美国Santa Cruz公司，光学显微镜购自日本Olympus公司。

1.3药剂制备 中药益坤宁主要成分：熟地30 g、黄芪30 g、山茱萸30 g、柴胡15 g、桂枝15 g、牡蛎30 g、麦冬20 g、当归20 g、甘草15 g、白芍20 g、龙骨30 g、茯苓20 g。所有药材经专家鉴定均符合中国药典2005年版的规定，将其制成水煎剂，高压密封后备用。

1.4建模及分组 30只13～14月龄大鼠经过连续15 d的阴道脱落细胞涂片检查确定存在动情周期紊乱、动情周期延长的现象，可作为围绝经期大鼠模型；按照随机数字表法分为模型组(10只)、替勃龙片(利维爱)组(10只)、益坤宁组(10只)。5月龄的大鼠纳入对照组(10只)。益坤宁组每天给予益坤宁1.12 g/kg，利维爱组每天予利维爱(荷兰N.V.Organon，注册证号：H20160575，规格：2.5 mg)0.26 g/kg，模型组和对照组每天予3 ml生理盐水。四组大鼠均连续灌胃给药4 w。

1.5细胞凋亡测定 在末次给药后1 d将所有大鼠断头处死，取出双侧卵巢，取部分卵巢组织置入4 %多聚甲醛中固定，进行常规的石蜡包埋切片，切片厚度为5 μm。采用TUNEL法检测细胞凋亡情况。二甲苯脱蜡处理，无水乙醇5 min、90%乙醇2 min、70%乙醇2 min、蒸馏水2 min，滴加20 μg/ml蛋白酶K(10 mmol/L Tris，HCl稀释)，在室温下放入湿盒中作用15～ 30 min。磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗3次，每次5 min。在切片上滴加50 μl新鲜配制 TUNEL反应混合物，在室温下放入湿盒中作用孵育1 h。PBS冲洗3次，每次5 min。3%H2O2甲醇液室温阻断10 min，室温孵育90 min，在切片上滴加50 μl POD，在室温下放入湿盒中作用30 min。PBS冲洗3次，每次5 min。DAB显色，苏木素复染。梯度乙醇中行常规脱水，二甲苯透明处理，滴加少量中性树胶，封片晾干。采用光学显微镜进行观察，细胞核呈棕黄色者为阳性凋亡细胞，细胞核呈蓝色者为阴性非凋亡细胞。采用JD-801显微图像分析系统进行图像采集，并分析细胞凋亡率。细胞凋亡率=染色阳性面积/视野总面积×100%。

1.6逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测各组大鼠caspase-3、ERα、ERβ mRNA表达 采用Trizol试剂提取卵巢组织中的总RNA，采用紫外可见分光光度计测定吸光度OD260 。取2.5 μg总RNA进行反转录合成cDNA第一链。采用Gene Runner软件设计大鼠caspase-3、ERα、ERβ的引物序列。caspase-3上游引物：5′-TCTGACTGGAAAGCCGAAACTC-3′，下游引物：5′-ACGGGATCTGTTTCTTTGCATG-3′，长度341 bp；ERα上游引物：5′-ACCAAAGCCTCGGGAATG-3′，下游引物：5′-GCTCGTTCTCCAGGTAGTAGGG-3′,长度403 bp；ERβ上游引物：5′-GAGCTCAGCCTGTTGGACC-3′，ERβ下游引物：5′-GGCCTTCACACAGAGATACTCC-3′，长度246 bp。以β-actin为内参，上游引物：5′-GTAAAGACCTCTATGCCAACA-3′，下游引物：5′-GGACTCATCGTACTCCTGCT-3′，长度511 bp。PCR 扩增：(1)变性：94℃，1 min ；(2)退火：55℃，1 min；(3)延伸：72℃，1 min。将扩增产物置于1.5%琼脂糖中进行凝胶电泳，GIS凝胶成像系统分析电泳条带。caspase-3、ERα、ERβ的相对表达量以其与β-actin灰度比值表示。

1.7蛋白印迹法检测各组大鼠caspase-3、ERα、ERβ蛋白表达 提取大鼠卵巢总蛋白,取适量样品，经10%聚丙烯酰胺凝胶电泳，转移于聚偏二氟乙烯膜上，加入3%BSA封闭60 min，加入稀释好的一抗(caspase-3、ERα、ERβ)，37℃孵育60 min。TTBS缓冲液清洗3 次，每次10 min，TBS洗膜10 min。加入用ALP标记的IgG，37℃孵育1 h，用TTBS缓冲液清洗3 次，每次10 min，TBS洗膜10 min。GIS凝胶成像系统分析电泳条带，采用β-actin作为内参。caspase-3、ERα、ERβ蛋白表达水平以其与β-actin灰度比值表示。

1.8统计学方法 应用SPSS19.0软件行t检验及单因素方差分析。

2 结 果

2.1四组细胞凋亡率比较 四组细胞凋亡率整体比较差异有统计学意义(P<0.05)。益坤宁组〔(9.24±1.61)%〕、利维爱组〔(9.13±1.42)%〕、对照组〔(9.26±1.28)%〕显著低于模型组〔(17.96±3.67)%〕(P<0.05)；益坤宁组、利维爱组、对照组两两比较差异无统计学意义(P>0.05)。

2.2四组卵巢组织caspase-3、ERα、ERβ mRNA比较 四组卵巢组织caspase-3、ERα、ERβ mRNA及蛋白水平整体比较差异有统计学意义(P<0.05)。益坤宁组、利维爱组、对照组的caspase-3 mRNA及蛋白水平显著低于模型组，ERα、ERβ mRNA及蛋白水平显著高于模型组(P<0.05)；益坤宁组、利维爱组caspase-3、ERα、ERβ mRNA均高于对照组，caspase-3蛋白表达明显高于对照组(P<0.05)；益坤宁组和利维爱组caspase-3、ERα、ERβ mRNA及蛋白水平比较差异均无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 四组卵巢caspase-3、ERα、ERβ mRNA及蛋白比较

与模型组比较：1)P<0.05；与对照组比较：2)P<0.05

3 讨 论

围绝经期妇女的卵巢功能明显衰退，雌激素分泌减少分，血液中雌激素浓度也明显降低，促卵泡激素(FSH)和黄体生成激素(LH)升高，导致下丘脑-垂体-卵巢轴之间出现失调，对自主神经中枢及其控制的各脏器功能造成影响，从而导致一系列自主神经功能失调的症状出现〔7，8〕。利维爱是一种具有弱雌激素、雄激素和孕激素活性的甾体激素，能明显抑制围绝经期妇女血浆中促卵泡激素水平，对黄体生成素抑制较轻，常用于治疗围绝经期综合征〔9〕。中药益坤宁具有补肾、疏肝、健脾的功效，可调节生殖内分泌系统，改善卵巢功能。相关研究显示,卵巢功能衰退时卵泡中大量颗粒细胞发生凋亡,这可能是引起卵泡闭锁 、卵泡发育停止的重要因素。卵巢功能衰退的严重程度与卵巢内细胞凋亡率显著相关〔10〕。结合结论可以推断，中药益坤宁具有预防和延缓卵巢内颗粒细胞凋亡的作用，阻止卵泡闭锁，获取更多卵泡，进而增加雌激素的分泌量，这可能是益坤宁治疗围绝经期综合征的机制之一。在细胞凋亡中caspase家族具有重要的作用，caspase-3是凋亡过程中最关键的功能蛋白酶，在整个凋亡过程中会多次被激活，同时可以激活下游的细胞死亡蛋白酶。在细胞凋亡末期的细胞裂解及凋亡小体形成的过程中，caspase-3必不可少〔11〕。由本研究结果可以推断，益坤宁可对围绝经期大鼠卵巢中caspase-3基因的转录和翻译起到抑制作用，进而降低caspase-3功能蛋白酶的表达,达到抑制卵巢细胞凋亡的目的。围绝经期最大的变化就是雌激素分泌减少，雌激素通过与ER结合发挥其生物作用，因此ER的数量能直接影响雌激素发挥作用的大小。ER主要有ERα、ERβ两组亚型，它们在人体内广泛分布。ERα、ERβ对于维持卵巢正常功能是必不可少的，对卵泡、卵母细胞的发育和成熟具有重要的作用〔12〕。本研究显示益坤宁能上调围绝经期大鼠卵巢中ERα、ERβ的表达，进而加强雌激素效应，减缓卵巢衰退。

4 参考文献

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