三七皂苷通过PPARγ调控SIRT1介导的狼疮肾炎小鼠脾淋巴细胞激素耐药及脂代谢影响的研究

丁伟森徐峥吴人照童晔玲鲁盈

1.浙江中医药大学 杭州 310053 2.浙江省中医药研究院 3.浙江省立同德医院

系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，SLE）是一种自身免疫功能紊乱所导致的系统性疾病，其中狼疮肾炎（lupus nephritis，LN）是SLE最常见和最严重的脏器损害。LN作为慢性肾脏病（chronic kidney disease，CKD）的一种，具有疾病活动与缓解交替、病程长、病情易反复及并发症多等特点[1-2]。糖皮质激素是目前国内外公认的控制狼疮活动，改善病情的一线药物[3]，它能快速缓解急性炎症状态、改善肾实质损伤，在LN缓解期治疗中发挥重要作用，极大地提高了患者的近期生存率[4]。但是，长期激素应用加之慢性炎症加剧了患者脂代谢紊乱[5-6]，导致动脉粥样硬化发生的风险大幅升高，严重威胁着患者的远期生存，尤其是激素耐药的难治性LN患者。

LN的中医病机中“瘀血”占有十分重要地位[7]，“瘀血”在动脉粥样硬化形成中同样占据着重要地位，如在冠心病常见中医证候要素中“瘀血”位居首位，血脂异常则是瘀血证相关危险因素之一[8-9]。活血化瘀中药可通过调节脂质代谢、稳定动脉粥样硬化斑块以及抗炎、抗血小板聚集等多种途径发挥抗动脉粥样硬化的作用，其中三七是最常被选用的药物[10-12]。研究证明，三七主要有效成分三七皂苷（Panax notoginseng saponin，PNS）能显著下调狼疮患者外周血淋巴细胞多药耐药基因编码蛋白P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）的表达，缓解激素耐药[13]；进一步研究证实沉默信息调节因子相关酶1（silent information regulation factor related enzyme 1，SIRT1）是调控 P-gp 表达的关键因子[14-15]。因此，深入研究活血化瘀中药调控LN激素耐药和改善脂代谢紊乱的机制具有重要意义。

本研究拟在前期研究基础上，从脂代谢角度出发，选择脂代谢调控的关键靶点之一的过氧化物酶增殖体活化受体γ（peroxidase activated receptor gamma，PPARγ）为切入点，初步研究其与SIRT1的相关性，进一步探索PNS在调控LN小鼠激素耐药和脂代谢紊乱中的效应以及相关作用机制。

1 材料和方法

1.1 实验动物 NZB/WF1 LN小鼠，雌雄各半，体质量20～24g，委托南京大学-南京生物医药研究院从美国 Jackson Laboratory进口 [许可证号：SCXK(苏)2017-0008]，饲养于浙江省中医药研究院动物中心[许可证号：SYXK(浙)2014-0003]。饲养条件：温度（21±1）℃，湿度 50%～60%，自由饮水，标准普通饲料喂养。实验动物饲养、使用、标本处置和操作均按照3R原则给予人道主义关怀。动物经适应性饲养7d后进行尿液代谢检测，测定24h尿蛋白含量。

1.2 主要试剂及仪器 小鼠红细胞裂解液购于碧云天生物技术有限公司（批号：20161015），注射用甲泼尼龙琥珀酸钠购于辉瑞制药有限公司（40mg/支，批号：20160904），PNS（血塞通注射液）购于广西梧州制药（集团）股份有限公司（批号：20160707），PPARγ siRNA和 PPARγ慢病毒质粒均委托吉玛制药技术有限公司（上海）合成和制备（批号：20161128、20170727），RNA提取试剂盒、Trizol试剂、RNA逆转录试剂盒、荧光定量RT-PCR反应试剂盒均购于TAKARA宝生物工程有限公司（批号：20170325、20170228、20170304、20170214），兔抗小鼠PPARγ及SIRT1抗体（一抗）、兔抗小鼠三磷酸腺苷结合盒转运体A1（adenosine triphosphate binding cassette transporter A1，ABCA1）流式检测抗体、FITC标记羊抗兔IgG多克隆二抗均购 于 Abcam 公 司 （ 批 号 ：20170207、20170218、20170910、20170215），细胞胞质蛋白和核蛋白提取试剂盒为碧云天生物技术有限公司产品（批号：20170211），Cholesterol/Cholesteryl Ester Assay 试 剂盒购于Abcam公司（批号：20170618）。流式细胞仪购于Beckman Coulter公司，Roche 480Ⅱ型RT-PCR仪为Roche公司产品，Flour Chem E高灵敏化学发光凝胶成像分析系统为ProteinSimple公司产品，Biotek Epoch 2酶标仪购于美国伯腾公司，Nikon TS100倒置荧光显微镜为Nikon公司产品。

1.3 方法

1.3.1 细胞模型制备 在生物安全柜中，采用密度梯度法分离NZB/WF1小鼠脾淋巴细胞，将淋巴细胞悬液加入24孔细胞培养板中，每孔培养体系为1mL，细胞浓度106个/mL。除对照组外，各孔均加入终浓度2μg·mL-1的甲基强的松龙，在 37℃、5%CO2培养箱中培养，分别于0、24、72h观察细胞形态变化，72h后收集细胞，以流式细胞术检测P-gp蛋白表达，Western blot检测SIRT1蛋白表达。参考文献[14-16]的结果，本实验中以SIRT1蛋白表达增高表示NZB/WF1小鼠脾淋巴细胞激素耐药诱导成功。

1.3.2 siRNA和慢病毒质粒转染 根据产品试剂盒及说明书进行操作。PPARγ序列：上游：5'-GCAAGAGAUCACAGAGUAUTT-3'， 下 游 ：5'-AUACU－CUGUGAUCUCUUGCTT-3'。慢病毒滴度：5×108TU·mL-1。转染72h后检测，感染复数（multiplicity of infection，MOI）值=10时说明已达到良好的转染和表达效率。

1.3.3 分组及干预 将小剂量甲基强的松龙诱导产生激素耐药的淋巴细胞，分为模型组（LN小鼠脾淋巴细胞激素耐药组）、PPARγ siRNA+PNS组、PPARγ质粒转染组和PNS组，并将未诱导激素耐药的NZB/WF1小鼠脾淋巴细胞作为对照组，每组设3个复孔。siRNA终浓度2μg·mL-1。慢病毒质粒按照MOI=10，即病毒数:细胞数=10:1加入每孔。PNS终浓度根据前期研究确定为200μg·mL-1[14]。培养72h后，提取各组细胞进行后续检测。

1.3.4 检测方法

1.3.4.1 Real-time PCR法检测各组淋巴细胞PPARγ和SIRT1 mRNA表达 参照Trizol抽提试剂盒及说明书，提取干预72h后的脾淋巴细胞总RNA进行逆转录反应。引物扩增设计见表1。逆转录反应条件：37℃ 15min，85℃ 5s，4℃保存。PCR 反应条件：95℃30min，1 个循环；95℃ 5s，60℃ 30s，共 40 个循环；95℃ 15s，60℃ 1min，95℃ 15s，1 个循环。将各组逆转录产物应用Roche 480Ⅱ PCR仪进行反应后得出Mean CT值，采用2-△△Ct法进行数据分析。

1.3.4.2 Western blot检测各组淋巴细胞PPARγ和SIRT1蛋白表达 按照试剂盒说明书分别提取胞质蛋白和核蛋白。以牛血清白蛋白为标准，以BCA法进行蛋白定量。取适量蛋白样品，10%SDS-PAGE电泳（300V，40min），300mA 转膜 2h，放入 5%脱脂牛奶中室温震荡封闭1h；一抗4℃过夜。TBST反复洗膜后，将膜与二抗进行孵育，室温摇床震荡1h，TBST洗膜后ECL显色，凝胶图像分析系统测定各带吸光度(A)值作定量分析。

表1 引物序列Fig.1 Primer sequence

1.3.4.3 荧光分光光度计检测各组淋巴细胞胆固醇酯的含量 将培养72h后的各组细胞用预冷PBS洗1～2次，Nonidet P40处理细胞，离心后转移橙色层液相至新的离心管，置于50℃烘箱中30min，每孔加入200μL Cholesterol Assay Buffer，震荡溶解，37℃ 5%CO2培养箱孵育1h后，荧光分光分度计按照Ex/Em=535/585nm，测定OD值。

1.3.4.4 流式细胞仪检测各组淋巴细胞ABCA1蛋白表达 提取培养72h后的各组细胞，以100μL含1%叠氮化钠和10%胎牛血清的PBS重悬，加入兔抗小鼠ABCA1抗体（一抗），室温孵育30min。离心后PBS洗3次。用100μL含5%牛血清白蛋白的PBS重悬，加入FITC标记的羊抗兔IgG多克隆抗体（二抗），室温避光孵育30min。离心后PBS洗3次。PBS 500μL重悬，流式细胞仪检测。

1.4 统计学分析 采用SPSS 18.0统计软件进行统计学分析。计量资料以±s表示。两组间均数比较采用方差分析，行正态性与方差齐性检验。多组间比较方差齐时采用LSD-t检验，方差不齐时采用Dunnett’s T3检验。计数资料组间比较采用χ2检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠脾淋巴细胞PPARγ和SIRT1 mRNA表达比较 与对照组比较，模型组PPARγ mRNA表达降低，SIRT1 mRNA 表达增高（P＜0.05）；与模型组比较，PPARγ siRNA+PNS组、PPARγ质粒转染组和PNS组PPARγ mRNA表达均上调，而SIRT1 mRNA表达均下调（P＜0.05），其中PPARγ质粒转染组与PNS组比较，SIRT1 mRNA表达差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

2.2 各组小鼠脾淋巴细胞PPARγ和SIRT1蛋白表达比较 与对照组比较，模型组中PPARγ蛋白表达降低，SIRT1蛋白表达增高（P＜0.05）；与模型组比较，PPARγ质粒转染组、PNS组PPARγ蛋白表达均增高（P＜0.05），而PPARγ siRNA+PNS组PPARγ蛋白表达无统计学差异（P＞0.05）；与模型组比较，PPARγ siR-NA+PNS组、PPARγ质粒转染组和PNS组中SIRT1蛋白表达均降低（P＜0.05）。见图1、表3。2.3 各组LN小鼠脾淋巴细胞内胆固醇酯含量比较与对照组比较，模型组和PPARγ siRNA+PNS组细胞

表2 各组小鼠脾淋巴细胞中PPARγ及SIRT1 mRNA表达（±s，n=3）Tab.2 Expression of PPAR gamma and SIRT1 mRNA in spleen lymphocytes of mice in each group(±s，n=3)

表2 各组小鼠脾淋巴细胞中PPARγ及SIRT1 mRNA表达（±s，n=3）Tab.2 Expression of PPAR gamma and SIRT1 mRNA in spleen lymphocytes of mice in each group(±s，n=3)

注：与对照组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05；与 PPARγ siRNA+PNS 组比较，△P＜0.05；与 PPARγ 质粒转染组比较，▲P＜0.05。Note:Compared with control group,*P＜0.05;compared with model group,#P＜0.05;compared with PPARγ siRNA and PNS group,△P＜0.05;compared with PPARγ plasmid transfection group,▲P＜0.05.

2.1584±0.0024*0.1037±0.0061*#0.0097±0.0033*#△0.0074±0.0092*#△1±0.0064组别 n mRNA相对表达量PPARγ SIRT1模型组PPARγ siRNA+PNS组PPARγ质粒转染组PNS组对照组3 3 3 3 3 0.0083±0.0042*0.0197±0.0085*#2.9281±0.0035*#△1.7654±0.0071*#△▲1±0.0053

图1 各组小鼠脾淋巴细胞中PPARγ及SIRT1蛋白表达Fig.1 Expression of PPAR gamma and SIRT1 protein in spleen lymphocytes of mice in each group

表3 各组小鼠脾淋巴细胞中PPARγ及SIRT1蛋白表达（±s，n=3）Tab.3 Expression of PPAR gamma and SIRT1 protein in spleen lymphocytes of mice in each group(±s，n=3)

表3 各组小鼠脾淋巴细胞中PPARγ及SIRT1蛋白表达（±s，n=3）Tab.3 Expression of PPAR gamma and SIRT1 protein in spleen lymphocytes of mice in each group(±s，n=3)

注：与对照组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05；与 PPARγ siRNA+PNS 组比较，△P＜0.05；与 PPARγ 质粒转染组比较，▲P＜0.05。Note:Compared with control group,*P＜0.05;compared with model group,#P＜0.05;compared with PPARγ siRNA and PNS group,△P＜0.05;compared with PPARγ plasmid transfection group,▲P＜0.05.

组别 n蛋白相对表达PPARγ/β-Actin SIRT1/β-Actin 0.99±0.03*0.87±0.02*#0.42±0.09*#△0.33±0.06*#△▲0.52±0.05模型组PPARγ siRNA+PNS组PPARγ质粒转染组PNS组对照组3 3 3 3 3 0.24±0.07*0.22±0.08*0.76±0.06*#△0.75±0.04*#△0.32±0.06

内胆固醇酯含量降低（P＜0.05）；而PPARγ质粒转染组、PNS组细胞内胆固醇酯含量升高（P＜0.05）。与模型组比较，PPARγ质粒转染组、PNS组细胞内胆固醇酯的含量均增高（P＜0.05）；但PPARγ siRNA+PNS组与模型组比较无统计学差异（P＞0.05）。见表4。

表4 各组小鼠脾淋巴细胞内胆固醇酯表达（±s，n=3）Tab.4 Cholesteryl ester expression in spleen lymphocytes of mice in each group（±s，n=3)

表4 各组小鼠脾淋巴细胞内胆固醇酯表达（±s，n=3）Tab.4 Cholesteryl ester expression in spleen lymphocytes of mice in each group（±s，n=3)

注：与对照组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05；与 PPARγ siRNA+PNS 组比较，△P＜0.05；与 PPARγ 质粒转染组比较，▲P＜0.05。Note:Compared with control group,*P＜0.05;compared with model group,#P＜0.05;compared with PPARγ siRNA and PNS group,△P＜0.05;compared with PPARγ plasmid transfection group,▲P＜0.05.

组别OD值0.762±0.071*0.824±0.045*2.347±0.032*#△2.036±0.087*#△▲1.413±0.035模型组PPARγ siRNA+PNS组PPARγ质粒转染组PNS组对照组

2.4 各组小鼠脾淋巴细胞ABCA1蛋白表达比较与对照组比较，模型组、PPARγ siRNA+PNS组ABCA1蛋白表达增高，PPARγ质粒转染组和PNS组ABCA1蛋白表达降低（P＜0.05）；与模型组比较，PPARγ siRNA+PNS组、PPARγ质粒转染组、PNS组中ABCA1蛋白表达均降低（P＜0.05），其中PNS组ABCA1蛋白表达下降程度最高（P＜0.05）。见图2。

3 讨论

三七是五加科多年生草本植物，具有止血、散瘀、定痛等作用，为活血化瘀，止血生新的要药。作为活血化瘀药的代表，它既能化瘀又能补虚，正符合SLE本虚标实的病机特点，也是临床上治疗LN的常用药。PNS是三七主要有效活性成分之一。既往研究表明，PNS具有调节脂代谢的作用[17]。药理学研究还发现，其具有抗血栓形成、抗缺血性损伤、抗血小板聚集、扩张小血管、改善肾血管微循环、增加肾血流量等作用[18]。本研究中证实PNS能够降低激素耐药LN小鼠脾淋巴细胞中SIRT1表达，结合前期研究结果[14-16]，再次证实PNS通过SIRT1/叉头转录因子（forkhead transcription factor 1，FoxO1）/多药耐药-1（multidrug resistance-1，MDR-1）/P-gp 信号通路降低 SIRT1 和P-gp表达，逆转LN鼠脾淋巴细胞激素耐药。

PPARγ是一类配体依赖的核受体转录因子，同时也是重要的激素受体，主要位于脂肪细胞、血管平滑肌细胞中，在淋巴细胞和巨噬细胞中也有分布[19]。研究证实，PPARγ是细胞脂代谢调控的关键靶标之一，主要参与细胞内脂质的合成[20-21]。SIRT1作为一种辅酶Ⅰ依赖性的Ⅲ类组蛋白去乙酰化酶，其底物就包括PPARγ[22]。在代谢性疾病领域的研究已证实PPARγ和SIRT1之间关系密切[23-24]。SIRT1通过对PPARγ的作用，促进“褐变”的白色脂肪组织分化和细胞内脂质合成[25]。在对慢性疾病防御机制的研究中发现，抑制SIRT1能够减轻成人高氧化应激和炎症反应[26]。本研究采用PNS和慢病毒质粒干预PPARγ，结果显示PNS既能提高激素耐药LN小鼠脾淋巴细胞内PPARγ表达，也能降低SIRT1表达，且对SIRT1表达的调控与PPARγ相关，一方面改善了LN淋巴细胞的激素耐药，另一方面调控了由PPARγ介导的细胞内脂代谢。

图2 各组小鼠脾淋巴细胞中ABCA1蛋白表达Fig.2 Expression of ABCA1 protein in spleen lymphocytes of mice in each group

研究发现，LN患者外周血总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白胆固醇水平较正常人群和不伴LN的患者增高[27]。众所周知，长疗程使用糖皮质激素可致LN患者外周血血脂水平升高。课题组在前项研究中也观察到，LN小鼠激素耐药模型外周血甘油三酯水平明显升高。研究证实，淋巴细胞内存在脂质代谢过程，而且细胞内的脂质调控水平与血清有所不同[28-29]。本项实验结果表明，激素耐药LN小鼠脾淋巴细胞内存在脂代谢紊乱，PNS可以提高细胞内胆固醇酯含量，改善脂代谢紊乱，维持正常脂质水平。ABCA1是一类依赖三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）的转运体膜蛋白。作为参与介导细胞内胆固醇流出的关键蛋白，ABCA1通过修饰细胞膜脂筏或直接激活信号通路介导脂质流出，发挥抗炎功能[30]，它能结合细胞表面贫脂或无脂的载脂蛋白A-Ⅰ(apolipoprotein A-Ⅰ，apoA-Ⅰ)，促进高密度脂蛋白生成，启动胆固醇逆向转运（reverse cholesterol transport，RCT）过程，对防止动脉粥样硬化形成具有重要意义[31-32]。本研究通过检测细胞内胆固醇酯含量和ABCA1蛋白表达，结果显示激素耐药LN小鼠脾淋巴细胞内胆固醇酯合成减少，含量降低，细胞内脂代谢出现紊乱；同时细胞内RCT过程异常激活，胆固醇外流增加。PNS干预能降低耐药小鼠脾淋巴细胞内ABCA1蛋白表达，提高细胞内胆固醇酯含量，结合前文所述PNS能提高耐药模型细胞内PPARγ表达，揭示PNS可能通过多个作用途径改善细胞内脂代谢紊乱，维持细胞内脂质水平。

综上所述，激素耐药LN小鼠脾淋巴细胞内存在脂代谢紊乱，PNS能通过上调PPARγ表达，降低SIRT1表达；并抑制ABCA1蛋白高表达和提高细胞内胆固醇酯含量，起到既逆转激素耐药又改善脂质代谢紊乱的双重效应。本研究结果表明以三七为代表的活血化瘀类中药存在多方面的作用，为临床运用中药逆转LN激素耐药，提高疗效，防治动脉粥样硬化，改善患者远期预后及生存质量提供了科学依据。

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