以DNA四面体为载体研究CpG对免疫Melan-A抗原肽协同作用

和晨辰 ，尹泽清 ，孙丽范 ，于 露 ，洪恩律 ，石文琦 ，李海东 ，沈万秋

（天津医科大学1.药学院；2.基础医学院；3.公共卫生学院，天津300070）

黑色素瘤是皮肤肿瘤中恶性程度最高的瘤种，容易出现远处转移，早期诊断和治疗尤为重要[1]。体外研究发现，T细胞可以特异性识别黑色素瘤Melan-A抗原肽,进而起到预防黑色素瘤细胞形成和抑制黑色素瘤细胞生长的作用[2]。CpG ODNS作为一种具有免疫刺激作用的治疗型核酸，可以触发细胞核内的TLR9受体，引起树突细胞成熟，提高免疫原性，被广泛用于传染性疾病。CpG ODNS其对于Melan-A抗原肽的预防及治疗黑色素瘤的效果具有一定的增强作用[2-3]。Romero教授实验室[4]将CpG与Melan-A抗原肽和佐剂混合，作为疫苗注射到HLA-A2＋黑色素瘤患者体内,发现其分泌了1~3倍免疫性细胞因子。但是CpG和Melan-A抗原肽之间的距离，及CpG数量对Melan-A抗原肽作用的影响还有待进一步研究。DNA纳米结构可定点修饰，控制修饰的点之间距离、位置及数量的特性及其先天的生物相容性、自组装性使其可用作良好的药物传递纳米载体[5-8]。其中，DNA四面体结构拥有合成简单，结构稳定优点，近来被优先作为药物纳米载体进行研究。Walsh等[9]证明DNA四面体可以进入细胞并且可以保证结构完整的在细胞中存在48 h；Li等[10]将有免疫刺激的CpG寡义核苷酸形成DNA四面体在细胞内进行培养，诱导免疫刺激，产生高水平的免疫因子包括肿瘤坏死因子（TNF）-α、IL-6、IL-12。Lee等[11]将能抑制或沉默癌细胞基因的siRNA和叶酸配体与四面体连接注射到移植瘤小鼠模型上，发现连有叶酸和siRNA的四面体可以靶向性地沉默肿瘤基因。Kim等[12]将阿霉素装载到四面体上，克服了乳腺癌细胞的耐药性。Xia等[13]将可穿透肿瘤细胞的肽链连接到四面体上，靶向地进入到癌细胞。这些研究进一步证明了DNA四面体结构是一个良好的药物传递纳米载体。在本论文中，笔者将CpG与Melan-A抗原肽连接在四面体上，将CpG与肽链固定位置并将距离拉近，研究CpG对具有免疫原性的Melan-A抗原肽预防黑色素瘤的协同作用。同时，笔者研究了增加连接的CpG个数对协同作用的影响。

1 材料与方法

1.1 动物、试剂及仪器 6周龄雌性C57小鼠（中国医学科学院研究所实验动物中心）；Melan-A抗原肽（吉尔生化上海有限公司）；Mouse IL-6 ELISA kit（北京达科为生物技术有限公司）；DNA和CpG单链（美国 Integrated DNA Technologies）；G-25microspin columns（GE Life Sciences），Spin-concentrators（Merck）；多功能酶标仪（美国Molecular Devices），高效液相色谱仪（美国 Agilent 1100）。

1.2 DNA和 CpG序列 TA（5′-ACA TTC CTA AGT CTG AAA CAT TAC AGC TTG CTA CAC GAG AAG AGC CGC CAT AGT A-3′）TB（5′-TAT CAC CAG GCA GTT GAC AGT GTA GCA AGC TGT AAT AGA TGC GAG GGT CCA ATA C-3′）TC （5′-TCA ACT GCC TGG TGA TAA AAC GAC ACT ACG TGG GAA TCT ACT ATG GCG GCT CTT C-3′）TD（5′-TTC AGA CTT AGG AAT GTG CTT CCC ACG TAG TGT CGT TTG TAT TGG ACC CTC GCA T-3′）1826TA（5′-TCC ATG ACG TTC CTG ACG TTT TTT T ACA TTC CTA AGT CTG AAA CAT TAC AGC TTG CTA CAC GAG AAG AGC CGC CAT AGT A-3′）1826TD（5′-TCC ATG ACG TTC CTG ACG TTT TTT T TTC AGA CTT AGG AAT GTG CTT CCC ACG TAG TGT CGT TTG TAT TGG ACC CTC GCA T-3′）

1.3 DNA链TC连接Melan-A抗原肽 氨基修饰DNA链与DBCO-sulfo-NHS（100 mmol/L pH 8.5磷酸盐缓冲液）于常温条件下，震荡2 h，再加入DBCO-sulfo-NHS（100 mmol/L pH 9.5磷酸盐缓冲液）于常温条件下，震荡2 h，生成DNA-DBCO。使用G-25 microspin columns将多余的DBCO-sulfo-NHS除去并浓缩体积。将DNA-DBCO与叠氮修饰的肽链在含有140 mmol/L NaCl的PBS溶液中进行反应，过夜。使用Spin-concentrators除去多余的肽链并浓缩体积，然后通过以TEAA与乙腈：水=90：10两种溶液作为流动相的高效液相进行提纯。

1.4 四面体纳米结构的准备 将4条DNA链等摩尔比值加入缓冲液中（50 mmol/L TAE，pH=8.0，50 mmol/L MgCl2）。溶液被加热到95℃5 min，然后迅速降到4℃。

1.5 建立小鼠模型 将C57小鼠分为3组，每组6只，同时分别腹腔注射等摩尔的四面体-Melan-A肽、四面体-Melan-A肽-CpG(I)、四面体-Melan-A肽-CpG（II），在不同时间眼内眦取血。将血液4℃静置1 h，2 000 r/min离心30 min，取上层血清。使用试剂盒和酶标仪对血清中的细胞因子浓度进行测定。

2 结果

2.1 DNA链TC与Melan-A结合 通过高效液相色谱图和质谱图，可以证明Melan-A抗原肽已经连接到DNA链上（图1，图2）。高效液相色谱图中9.853处峰为未修饰的DNA，16.052处峰为DBCODNA，17.031处峰为DNA-Melan-A肽。质谱图中18 540.129峰为DNA-Melan-A抗原肽的相对分子质量。

图1 DNA-肽高效液相色谱图Fig 1 HPLC spectrum for DNA-Melan-A peptide

2.2 构建DNA四面体结构 由55个碱基的DNA链、DNA-肽、1826TA、1826TD通过自组装形成正四面体结构。将DNA-Melan-A抗原肽、DNA-CpG链与其他未修饰DNA链结合形成四面体-Melan-A肽、四面体-Melan-A肽-CpG(I)和四面体-Melan-A肽-CpG(II)（图3）。

图3 四面体-Melan-A 肽（A）、四面体-Melan-A 肽-CpG(I)（B）、四面体-Melan-A肽-CpG(II)（C）结构示意图Fig 3 Synthetic scheme for the Tetrahedron-Melan-A peptide,Tetrahedron-Melan-A peptide-CpG (I),Tetrahedron-Melan-A peptide-CpG(II)

2.3 DNA四面体的结构表征 聚丙烯酰胺凝胶电泳的结果证明3种结构可以形成（图4）。

图4 聚丙烯酰胺凝胶电泳图Fig 4 Polyacrylamide gel

2.4 C57小鼠细胞因子变化 对小鼠血清中的细胞因子进行测定，3组的IL-6逐组增加。结果显示将Melan-A抗原肽和CpG固定在DNA四面体上，产生的细胞因子分别为9.238 pg/mL、17.150 pg/mL、18.865 pg/mL（图 5）。

图5 小鼠血清IL-6浓度图Fig 5 Mouse serum IL-6 concentration

3 讨论

本实验成功设计了特定结构的DNA四面体，人工修饰Melan-A抗原肽和CpG。证明修饰的四面体结构可稳定存在，通过注射到小鼠体内，测量到四面体-肽-CpG（I）的IL-6细胞因子浓度比四面体-Melan-A肽增高了7.912 pg/mL，四面体-Melan-A肽-CpG（II）增高了9.627 pg/mL。实验证明DNA四面体纳米结构能够定点修饰CpG和Melan-A抗原肽，并可控地修饰CpG数量，增强了CpG和Melan-A抗原肽的协同作用，是药物传递的优良纳米载体，可用于预防和治疗黑色素瘤。

在未来的研究中，笔者将探究四面体-肽-CpG能否抑制小鼠体内黑色素瘤的生长以及能否杀死黑色素瘤细胞，为今后黑色素瘤的治疗提供新的可能。

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