IL-17A促进卵巢癌顺铂耐药的体外机制探讨

徐灵灵，牛秀珑，张宏健，李稚君，陈 燕，邓为民

（1.天津医科大学免疫学系，天津300070；2.中国人民武装警察部队后勤学院附属医院感染性疾病科，天津300162；3.天津医科大学总医院输血科，天津300052；4.天津医科大学总医院骨科，天津300052）

白介素17A（interleukin-17A,IL-17A）也叫IL-17，是IL-17家族的一个原型成员，IL-17家族包括6种细胞因子，IL-17A到IL-17F，包括5种受体，IL-17RA到IL-17RE[1-2]。IL-17A除了主要来源于辅助型T细胞17（T helper cell 17），也可来源于自然杀伤（NK）T细胞、γδT细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和先天免疫淋巴细胞[3-8]。卵巢癌（ovarian cancer，OVCA）是女性生殖系统三大恶性肿瘤之一，其发病率仅次于宫颈癌和子宫内膜癌，病死率居于首位。大多数患者就诊时已属中晚期。手术联合化疗、内分泌治疗是卵巢癌的主要治疗手段，但化疗耐药性的产生使肿瘤的预后效果较差[9-11]。前期的研究结果表明IL-17A可加剧卵巢癌顺铂（cisplatin,DDP）耐药性，增加DDP降低的A2780和OVCAR3细胞活性[12]。为进一步探讨IL-17A对卵巢癌化疗耐药性的调节作用及其机制，本文旨在采用流式细胞术分析外源性重组人IL-17A（rhIL-17A）对卵巢癌细胞经顺铂作用后细胞凋亡和细胞周期的变化，为改善卵巢癌化疗耐药性提供一种新的策略。

1 材料与方法

1.1 实验材料 人卵巢癌细胞系（A2780、OVCAR3）购自美国ATCC公司，本实验室惠存；RPMI-1640培养基购自美国Sigma公司；胎牛血清（FBS）购自美国GIBCO公司；重组人IL-17A的中和抗体（rhIL-17RAmAb）购自美国R&D公司；rhIL-17A购自美国PeproTech公司；顺铂（CDDP or DDP）购自中国齐鲁医药公司；Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒购自中国南京凯基生物科技发展有限公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 A2780和OVCAR3细胞系用含有10%FBS的RPMI-1640培养基培养于培养箱中，每1～2 d更换培养液并消化传代，培养箱条件为37℃，CO2浓度5%，湿度95%。

1.2.2 流式细胞技术检测细胞凋亡 取对数生长期A2780和OVCAR3细胞接种于12孔板，每孔为1×105/1 mL，37℃二氧化碳孵箱孵育24 h后去掉培养基，加入5%FBS培养基继续孵育24 h使细胞同步化。先加入rhIL-17A（1 ng/mL），再加入顺铂（A2780：10 μmol/L；OVCAR3：100 μmol/L），同时用细胞因子稀释液（0.1%BSA-PBS）和/或等量的生理盐水（顺铂稀释液）作为对照。分组如下：（1）control；（2）rhIL-17A 1 ng/mL；（3）DDP 10 μmol/L（A2780）/DDP 100 μmol/L（OVCAR3）；（4）rhIL-17A 1 ng/mL+DDP 10 μmol/L （A2780）/DDP 100 μmol/L（OVCAR3）；（5）rhIL-17A 1 ng/mL+DDP 10 μmol/L（A2780）/DDP 100 μmol/L（OVCAR3）+IL-17RAmAb 3 μg/mL；（6）rhIL-17A 1 ng/mL+DDP 10 μmol/L（A2780）/DDP100μmol/L（OVCAR3）+IL-17RAmIgG；先加入 IL-17RAmAb（3 μg/mL）预处理 1 h，然后再加入 rhIL-17A（1 ng/mL）或 DDP 10 μmol/L（A2780）/DDP 100 μmol/L（OVCAR3）。37 ℃二氧化碳孵箱孵育24 h。培养结束后，用0.25%胰酶（不含EDTA）消化收集细胞。预冷0.1%BSA-PBS离心5 min后，洗2次。加入500 μL缓冲液混悬细胞。加入5μL Annexin V-FITC 混匀，再加入 5 μL 碘化丙啶（PI），混匀。避光室温孵育10 min。1 h内，用流式细胞仪检测。细胞经过400目筛网过滤成单细胞悬液备检。设置波长，收集细胞；Annexin V-FITC绿色荧光通过FITC通道（FL1）检测；PI红色荧光通过PI通道（FL2）检测。同时将正常细胞（未经凋亡诱导处理）作为对照进行荧光补偿调节，以去除光谱重叠和设定十字门的位置。CFlow Plus 1.0.264.15（BD AccuriC6）软件分析结果[12]。

1.2.3 流式细胞技术检测细胞周期分布 细胞处理同细胞凋亡检测。先加入rhIL-17A（1ng/mL），再加入顺铂（A2780：10 μmol/L；OVCAR3：100 μmol/L），同时用细胞因子稀释液（0.1%BSA-PBS）和/或等量的生理盐水（顺铂稀释液）作为对照。分组如下：（1）control；（2）rhIL-17A 1 ng/mL；（3）DDP 10 μmol/L（A2780）/DDP 100 μmol/L（OVCAR3）；（4）rhIL-17A 1 n g/mL+DDP 10 μ mol/L （A2780）/DDP 100 μ mol/L（OVCAR3）。培养结束后，用0.25%胰酶（不含EDTA）消化收集细胞。预冷0.1%BSA-PBS离心5 min，洗2次。70%冰乙醇重悬细胞放于-20℃过夜。将过夜固定细胞离心去除乙醇，随后沉淀中加入核糖核酸酶 A（RNase A；50 μg/mL），37℃水浴 30 min终止RNase A作用；再加入终浓度为0.1%聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100）、50 μg/mL 的 PI，避光 4 ℃孵育40 min。细胞经400目筛网过滤成单细胞悬液备检。设置波长。收集细胞，通过FL2通道检测PI红色荧光。CFlow Plus 1.0.264.15（BD Accuri C6）软件分析结果，确定细胞周期分布[12]。

2 结果

2.1 rhIL-17A通过IL-17RA抑制DDP诱导的A2780和OVCAR3细胞凋亡 与对照组相比，1 ng/mL rhIL-17A对A2780和OVCAR3细胞的凋亡水平无明显影响；经1 ng/mL rhIL-17A预处理24 h后，DDP对A2780和OVCAR3细胞的毒性作用明显减弱，A2780细胞的凋亡率由（25.8±3.3）%降低为（15.0±0.8）%；OVCAR3细胞的凋亡率由（19.2±1.0）%降低为（11.7±1.9）%。以 IL-17RA mAb进行阻断实验可部分消除rhIL-17A对DDP诱导的A2780和OVCAR3细胞凋亡的阻滞作用。上述结果提示，单独外源性rhIL-17A作用不影响OVCA细胞的凋亡水平；外源性rhIL-17A可通过抑制细胞凋亡来抑制卵巢癌细胞对DDP的敏感性，增强细胞对DDP的耐受性。见图1。

2.2 rhIL-17A能够抑制DDP诱导的A2780和OVCAR3细胞周期阻滞 与对照组相比，单独rhIL-17A（1 ng/mL）作用对A2780和OVCAR3细胞的周期分布无明显影响；DDP处理后，可使A2780和OVCAR3细胞的G0/G1期比例减少，G2+S期比例增加，说明DDP可将细胞阻滞于G2期，进而抑制细胞的增殖；但rhIL-17A预处理细胞2 h后，再加入DDP，可使A2780和OVCAR3细胞的G0/G1期比例增加，G2+S期比例减少，说明rhIL-17A可抑制由DDP诱导的A2780和OVCAR3细胞周期阻滞，进而抑制DDP的细胞毒性作用。见图2。

图1 rhIL-17 A对DDP诱导的A2780和OVCAR3细胞凋亡的影响Fig 1 The effect of cell apoptosis of rhIL-17A on A2780 and OVCAR3 cells treated with DDP

图2 rhIL-17A对DDP诱导的A2780和OVCAR3细胞周期分布变化的影响Fig 2 The effect of rhIL-17A on cell cycle changes of A2780 and OVCAR3 cells treated with DDP

3 讨论

卵巢癌是常见的女性生殖系统恶性肿瘤，病死率高，预后差[13]。目前标准治疗方案是以手术为主，辅以放化疗的综合方案，然而疗效不是很理想，大部分患者治疗达到临床完全缓解后，会出现复发及转移，因此卵巢癌患者的5年生存率不到30%[13]。耐药性的发生是影响卵巢癌治疗效果的主要原因。顺铂是一种广泛应用的化疗药物，以顺铂为基础的新辅助化疗方案已经应用于多种肿瘤的综合治疗，包括卵巢癌、骨肉瘤、小细胞肺癌等。但固有性或获得性顺铂耐药的产生极大地影响了肿瘤化疗的临床效果。

IL-17A是一种多效性细胞因子，具有增强炎性免疫反应的生物学活性，是构成肿瘤微环境的重要成分之一，在多种肿瘤的发生发展中发挥不同的作用。包括卵巢癌在内的多种肿瘤细胞可表达IL-17RA[12]。笔者的前期研究发现，外源性IL-17A可通过IL-17RA直接作用于卵巢癌细胞，通过Gli1介导的Hedgehog（Hh）信号通路增加耐药相关基因三磷酸腺苷结合盒超家族G家族第2个成员（ATP-binding cassette super-family G member 2,ABCG2）和多药耐药蛋白（muti-drug resistance 1,MDR1）的表达水平，从而促进OVCA的DDP耐药，并可增加DDP降低的A2780和OVCAR3细胞活性[12]。

据文献报道，DDP对肿瘤细胞的毒性作用往往能够改变细胞周期分布，进而导致细胞凋亡[14]。为了进一步探讨IL-17A诱导卵巢癌细胞DDP耐药性的发生机制，本实验组采用流式细胞术分析外源性rhIL-17A对卵巢癌细胞经顺铂作用后细胞凋亡和细胞周期的变化。结果表明rhIL-17A自身对卵巢癌细胞凋亡没有直接的影响，但与DDP共存时，可显著降低DDP诱导的A2780和OVCAR3细胞凋亡，并且该效应可被IL-17RAmAb部分消除。进一步研究发现，rhIL-17A自身对卵巢癌细胞的周期分布没有直接影响，但加入DDP后，rhIL-17A可抑制由DDP造成的细胞周期阻滞，抑制DDP的细胞毒性作用。

综上所述，外源性的rhIL-17A对卵巢癌细胞的凋亡及周期分布没有直接的影响，但可通过IL-17RA抑制DDP所引起的卵巢癌细胞的凋亡及周期分布变化。

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