LC-ESI-MS/MS测定白酒中甜味剂纽甜的方法研究

周玉，董孝元，余义，刘莎，唐艳荣，陈佳麟，时宏伟，*

（1.武汉天龙黄鹤楼酒业有限公司，湖北武汉430050；2.健民药业集团股份有限公司，湖北武汉430050）

甜味剂是改善食品口味的一种食品添加剂，有着低热量、高甜度、适合糖尿病病人适用等特点而成为蔗糖替代品在食品中广泛使用。纽甜是一种新型的非营养高倍甜味剂，甜度为蔗糖的7 000倍～13 000倍，口味纯正，甜感清爽，持续时间长，纽甜的安全性、有效性、稳定性、经济性及环保性等多方面的系统评价得出纽甜为可取代阿斯巴甜且具广阔应用前景的二肽类甜味剂[1-4]。甜味剂尽管应用范围很广，但是在白酒中是不允许添加的[5]。

白酒是我国的传统蒸馏酒，按其风味特征可分为各种不同的香型，虽然每种香型各有其典型风格，但是不论哪种香型的白酒，保持适度的甜味，不仅可以遮盖其他一些苦涩杂味，而且还能使酒体甘冽、醇厚、绵软，但是这种甜味是来自于自然发酵产生的，而非添加甜味剂。风味化学研究表明，味觉是由一定的呈味物质引起的，酒之所以具有醇甜之感，是因为酒中含有一定量的甜味物质，如高级醇、多元醇、氨基酸等，这些甜味物质，对于名优白酒，是由其特殊的生产工艺决定的，如浓香型大曲酒的低温入池、缓慢发酵，就是为了有利于醇甜物质的生成，无需另行添加[6-10]。

人工合成甜味剂可能对人体有致癌、致病的副作用[6]，因而已被许多国家限制使用。尤其在白酒行业，GB 2760-2014《食品安全国家标准食品添加剂使用标准》中规定白酒中甜味剂不得检出。所以对于白酒中甜味剂的测定应该做到严格把关，防止行业和白酒企业中出现假冒伪劣产品，对消费者产生不利影响。目前，关于纽甜的检测方法主要有液相色谱-质谱联用法[11-17]、高效液相色谱法[18-19]、离子交换色谱法[20]、毛细管电泳法[21]、气相色谱法[22]。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

纽甜（规格100 mg，储存温度-20℃）：上海安谱实验科技股份有限公司；甲醇（色谱纯）：美国Baker公司；乙酸（分析纯）：天津市天力化学试剂有限公司；蒸馏水（规格600 mL）：广州屈臣氏食品饮料有限公司。

1.2 仪器与设备

Agilent 1260LC-Agilent 6460安捷伦三重串联四级杆质谱仪、Agilent ZORBAX RX-C18安捷伦色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）：安捷伦科技有限公司；有机滤膜（孔径0.22 μm）、全玻璃微孔过滤器（规格1 000 mL）：天津津腾实验设备有限公司。

1.3 方法

1.3.1 标准溶液配制

准确称取10 mg（精确至0.000 1 mg）纽甜标准品于100 mL容量瓶中，用蒸馏水溶解并定容至100 mL），配制成100 mg/L的标准储备液，置于4℃冰箱中保存。根据使用需要用蒸馏水逐级稀释成适当浓度的混合标准工作液。

1.3.2 样品前处理方法

用一次性注射器吸取均质样品，经0.22 μm的有机滤膜过滤，滤液供液相色谱-质谱联用仪测定。

1.3.3 色谱条件

色谱柱：Agilent ZORBAX RX-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：A 为 0.1%乙酸溶液，B 为甲醇；流动相体积比：A ∶B=20 ∶80；流速：0.4 mL/min；柱温箱：25 ℃；进样量：2 μL。

1.3.4 质谱条件

离子源：电喷雾离子源；扫描方式：正离子扫描；检测方式：多反应检测模式；干燥气体温度：325℃；干燥气体流速：6 L/min；喷雾电压：206.8 kPa。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件和质谱条件的优化

2.1.1 质谱条件的优化

采取直接进样的方式，将目标物标准溶液注入质谱，分别进行正离子模式和负离子模式全扫描检测，得到一级质谱图和准分子离子峰，再用惰性气体氮气攻击该母离子，获得其二级质谱图及相应的子离子。结果表明在正离子模式下响应值及灵敏度均高于负离子模式，因此，本方法选择正离子电离模式。利用多反应监测模式（multiple reaction monitoring，MRM））对选定的定性离子和定量离子对碎裂电压、碰撞能、保留时间、碰撞池加速电压等质谱参数进行优化，使各监测离子丰度和信号达到最佳。正离子模式下的质谱分析参数见表1。

表1 纽甜的质谱参数Table 1 Mass parameters for analysis of neotame

2.1.2 色谱条件的优化

分别以0.1%乙酸-甲醇、0.1%乙酸-乙腈、2mmol/L乙酸铵-甲醇作为流动相进行样品分离。结果表明，用0.1%乙酸-甲醇作为流动相时物质分离度、峰形、响应值以及保留时间的稳定性均优于0.1%乙酸-乙腈、2 mmol/L乙酸铵-甲醇，故本方法最终选用0.1%乙酸-甲醇为流动相进行洗脱。纽甜在优化的色谱和质谱条件下的MRM色谱图，见图1。

2.2 线性范围、检出限和定量限

线性范围、检出限和定量限参照Gan Zhiwei，Pro bir Kumar Ojha等[23-24]的方法，将纽甜标准储备液用蒸馏水稀释，分别配制成5种浓度为50、100、200、500、1 000 μg/L的标准工作液，按1.5节所述的色谱-质谱条件进行测定，绘制标准工作曲线，见图2。

图1 纽甜的多反映监测色谱图Fig.1 Chromatogram of neotame in MRM mode

图2 纽甜的线性相关系数Fig.2 Linear correlation coefficients of neotame

结果显示，在50 μg/L～1 000 μg/L的浓度范围内，所有分析物的质量浓度x（μg/mL）和响应值y之间线性相关系数为0.999 99；以性噪比为3确定检出限为50 μg/L，以性噪比为 10 确定定量限为 200 μg/L。

2.3 精密度和回收率

精密度和回收率参照 H.Ozer，Elisabeta-Irina Geana等[25-26]的方法，采用在空白样品中添加标准溶液的方法，选择常见的浓香型和兼香型两个不同香型白酒酒样及乙醇进行的纽甜检测试验，成品白酒1、2和乙醇3的纽甜含量均为未检出，并向两个样品中分别添加200、500 μg/L二个浓度水平的纽甜进行回收率实验，重复测定2次。共6组平行，12次检测，结果表明，在重复性条件下获得的两次独立测定结果的相对偏差小于2%，且回收率均在85%～105%率范围内，所以该方法的精密度和回收率均符合相关标准要求。

2.4 与国标法比对

选择常见的4种不同类型白酒酒样添加纽甜，将本方法与国标GB 5009.247-2016《食品安全国家标准食品中纽甜的测定》方法进行加标测回收率结果比对，比对结果见表2。

表2 方法结果比对Table 2 Comparison of methods

将本方法和国标方法的数据进行比较，两组数据的绝对偏差小于1，相对偏差小于5%。国标方法中纽甜的定量限是0.2 mg/L；本方法的检出限是0.05 mg/L，定量限是0.2 mg/L。结果表明，本方法可以用于白酒中纽甜的检测。相比液相色谱系统，液相质谱联用仪具有更高的分离度和灵敏度以及更短的检测时间。

3 结论

本研究利用液相色谱-质谱联用仪分析了白酒中甜味剂纽甜化合物的分子信息，利用多反应监测模式的液相色谱-质谱联用仪技术，建立了一个快速、稳定、灵敏的可定性定量纽甜的方法。该方法可在15 min内完成，其检测范围内线性良好（r=0.999 99）；检出限0.05 mg/L；定量限 0.2 mg/L；精密度＜2%；回收率＞85%；且与国标中的检测方法相比检出限更低，能更加有效的监控白酒中纽甜的含量，综上所述该方法可以对纽甜进行实际的定性定量检测。

[1]姚明静,季斌,刘丽萍,等.白酒中常见的七种甜味剂检测方法及来源的研究进展[J].酿酒科技,2017(5):1-6

[2]朱明婧,刘博,李飞飞.天然甜味剂研究进展与开发前景分析[J].中国调味品,2015(11):136-140

[3]杨双春,刘慧芳,王健,等.国内外人工合成的非能量型甜味剂研究现状[J].食品工业,2013(4):181-184

[4]Bryant Charlotte,Mclaughlin John.Lowcalorie sweeteners:Evidence remain slacking for effects on human gut function[J].Physiology&behavior,2016(14):62-64

[5]杨君,王建华,刘靖靖,等.食品中甜味剂的检测技术研究进展[J].化学分析计量,2013(5):100-103

[6]孙棣,冯永渝,梁桂娟.白酒中甜味剂的检测及其来源的探讨[J].中国酿造,2015(7):142-146

[7]Zhu L,Wang G,Dong B.Effects of sweetener neotame on diet preference,performance and hematological and biochemical parameters of weaned piglets[J].Animal Feed Science and Technology,2016(5):14

[8]M C Yebra-Biurrun.Sweeteners[M].Netherlands:ElsevierInc,2013:12-13

[9]刘石雪,唐丽云.高效液相法测定白酒中纽甜含量影响因素的探究[J].酿酒科技,2017(6):9-11

[10]潘红,邢卉研,胡丽,等.液相色谱质谱联用仪同时测定白酒中5种甜味剂含量[J].科技经济导刊,2016(7):100-101

[11]吴世嘉,王洪新,陶冠军.超高压液相色谱—质谱同时测定白酒中6种微量甜味剂的方法研究[J].食品与生物技术学报,2010,29(5):670-675

[12]王丽,俞心愉,李磊.超高效液相色谱-高分辨质谱法快速检测白酒中4种甜味剂[J].中国卫生检验杂志,2014,24(22):3244-3246,3250

[13]梅婕,司冠儒,张温清,等.高效液相色谱-串联质谱法测定白酒中6种甜味剂[J].酿酒科技,2016(3):122-124

[14]Jian-YeGUI,Wei SUN,Chen-Ling ZHANG,et al.An Innovative Approach to Sensitive Artificial Sweeteners Analysis by Ion Chromatography-Triple Quadrupole Mass Spectrometry[J].Chinese Journal of Analytical Chemistry,2016,44(3):32-33

[15]Romina Shah,Samantha Farris,LowriS DeJager,et al.Anovel method for the simultaneous determination of 14 sweeteners of regulatory interest using UHPLC-MS/MS[J].Food Additives&Contaminants:PartA,2015,32(2):12-14

[16]牛之瑞,王秀君,于毅涛,等.液相色谱-质谱联用同时测定白酒中8种甜味剂[J].食品科学,2016(2):178-181

[17]Hiroaki Sakai,Azusa Yama shita,Masayoshi Tamura,et al.Simultaneous determination of sweeteners inbeverages by LC-MS/MS[J].Food Additives&Contaminants:PartA,2015,32(4):62-63

[18]刘芳,王彦,王玉红,等.固相萃取-高效液相色谱-蒸发光散射检测法同时检测食品中5种人工合成甜味剂[J].色谱,2012(3):292-297

[19]Kakigi Y,Suzuki T,Icho T,et al.Classification of stevia sweeteners in soft drink susing liquid chromatography and time-of-flight mass spectrometry[J].Food Additives&Contaminants:PartA,2013,30(12):21-22

[20]桂建业,孙威,张辰凌,等.离子色谱-串联质谱法分析环境水体中痕量人工甜味剂[J].分析化学,2016(3):361-366

[21]薛洪宝,张晖,梁丽丽,等.高效毛细管电泳法测定食品中5种甜味剂含量[J].食品与生物技术学报,2014(3):315-320

[22]阮丽萍,蔡梅,吉文亮,等.高效液相色谱-串联质谱法同时测定调味品中8种人工合成甜味剂[J].中国食品卫生杂志,2013(4):331-335

[23]Gan Zhiwei,Sun Hongwen,Wang Ruonan,et al.Anovel solid-phase extraction for the concentration of sweeteners in water and analysis by ion-pair liquid chromatography-triple quadrupole mass spectrometry[J].Journal of Chromatography A,2013(4):52-55

[24]Probir Kumar Ojha,KunalRoy.Development of arobust and validated 2D-QSPR model for sweetness potency of diverse functional organic molecules[J].Food and Chemical Toxicology,2017(1):32-36

[25]Ozer H,Psimouli V,Ozcan N,et al.Oreopoulou.Ringtrial for the simultaneous analysis of sweeteners and preservatives in soft drinks[J].QualityAssuranceandSafetyofCrops&Foods,2013,5(1):6-12

[26]Elisabeta-Irina Geana,Andreea-Maria Iordache,Roxana Elena Ionete.Simultaneous determination of artificial sweeteners in possible counter feited wines,using high performance liquid chromatography with DAD detection[J].Analele Universitatii“Ovidius”Constanta-Seria Chimie,2012,23(1):14-17