腹腔注射趋化因子受体2抑制剂RS102895、色甘酸钠对小鼠间质性膀胱炎的预防观察

王鑫朋，孙二琳，张东正，赵坤，刘春雨，刘利维

(1 沧州市中心医院，河北沧州061001；2 天津医科大学第二医院)

间质性膀胱炎(IC)是指在膀胱镜下具有典型的膀胱点状出血、膀胱壁 Hunner 溃疡及相关组织学特征的一种疾病[1]。IC的主要的病理生理变化为肥大细胞在膀胱黏膜下层及膀胱肌层的活化和聚集[2]。多数学者[3]认为IC的发病机制是“肥大细胞假说”，但其具体发生机制目前尚不明确。肥大细胞被激活后脱颗粒可释放组胺、5-羟色胺、类胰蛋白酶等多种活性物质。单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)又称单核细胞趋化和激活因子，属于C-C亚族(β亚族)成员，起初是从人髓样单核细胞系THP-1、神经胶质瘤细胞系以及脂多糖(LPS)或PHA刺激的人外周血单个核细胞培养上清中发现。研究[4]发现，MCP-1对单核细胞和嗜碱粒细胞有趋化作用，能使嗜碱粒细胞和肥大细胞脱颗粒。趋化因子受体2(CCR2)是肥大细胞表面MCP-1受体，MCP-1可与CCR2发生特异性结合[5]。研究[6]发现，IC患者尿液和膀胱组织中MCP-1的水平和表达均升高，但具体机制尚不明确。2016年6月～2017年1月，我们观察了腹腔注射CCR2抑制剂RS102895、肥大细胞稳定剂色甘酸钠对小鼠IC的预防作用。现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 药物、实验动物、试剂及仪器 趋化因子受体CCR-2抑制剂RS102895购自Tocris公司，肥大细胞稳定剂色甘酸钠购自美国Sigma公司。4～6周龄BALB/c雌性小鼠36只，体质量17～20 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，LPS购自美国Sigma公司，硫酸鱼精蛋白(PS)购自美国Sigma公司，MCP-1 ELISA试剂盒购自美国eBioscience公司，组胺ELISA试剂盒购自Abvona公司，酶标仪购自美国BioTek公司。

1.2 小鼠分组、给药方法 36只雌性BALB/c小鼠采用随机数字表法分为A、B、C、D组，每组9只。A、B、C组制作小鼠IC模型：0.06 mL/10 g的剂量腹腔注射5%水合氯醛麻醉，麻醉满意后排空膀胱，继续膀胱灌注50 g/L PS(约0.1 mL)，在膀胱内保留45 min，再次排空膀胱，生理盐水冲洗3次，灌注750 μg/mL的 LPS溶液并保留30 min，再次排空膀胱；每隔7天灌注1次，共灌注3次。A组首次膀胱灌注后1.5 h即按照5 mg/kg腹腔注射RS102895，1次/d,共注射21 d；B组首次膀胱灌注前2天即开始腹腔内注射色甘酸钠溶液50 mg/kg，1次/d,共注射23 d；C组每日注射等体积PBS溶液，共注射21 d。D组为空白对照。首次膀胱灌注记为第1 d第5 d使用反射排尿法收集各组小鼠尿液；第22 d拉颈处死各组小鼠，10%甲醛固定膀胱标本，备用。

1.3 炎症指标观察方法

1.3.1 各组膀胱组织黏膜和固有层炎性变化观察 取各组膀胱组织，常规石蜡包埋，切片，随机选取5张切片行HE染色。显微镜下观察膀胱组织黏膜和固有层炎性变化。

1.3.2 各组膀胱固有层及逼尿肌中肥大细胞、脱颗粒细胞观察 取各组膀胱组织，石蜡包埋后切片，行甲苯胺蓝染色。随机选取甲苯胺蓝染色后的切片中的10个高倍视野，测算各组镜下肥大细胞数、脱颗粒细胞百分比。

1.3.3 各组尿液MCP-1、组胺水平检测 收集各组尿液，2 h内分别用MCP-1、组胺ELISA试剂盒检测尿液MCP-1、组胺，所有操作及样本准备均严格按照使用说明书进行。用酶标仪在450 nm 波长处测量其光密度值 (OD值)；根据标准品OD值绘制标准曲线，测算各组尿液MCP-1、组胺含量。

2 结果

2.1 各组膀胱组织炎性变化 C组膀胱炎性反应最重，可见大量炎性细胞浸润，膀胱黏膜上皮剥脱并可见组织水肿、充血；A、B组炎性反应较轻，膀胱上皮相对完整；D组未见炎性细胞浸润，膀胱上皮完整，见图1。

2.2 各组膀胱固有层及逼尿肌中肥大细胞计数、脱颗粒细胞百分比比较 各组膀胱固有层及逼尿肌中肥大细胞计数、脱颗粒细胞百分比比较见表1。

2.3 各组尿液MCP-1、组胺比较 各组尿液MCP-1、组胺含量比较见表2。

3 讨论

图1 各组小鼠膀胱组织炎性变化(200×)

组别肥大细胞计数(个)脱颗粒肥大细胞百分比(%)A组3.44±1.24*#34.39±4.98*#B组2.78±1.39*#44.73±7.02*#C组16.33±3.57*83.96±6.56*D组1.44±0.8817.28±3.17

注：与D组比较，＊P<0.05；与C组比较，#P<0.05。

表2 各组尿液MCP-1、组胺含量比较

注：与D组比较，＊P<0.05；与C组比较，#P<0.05。

IC的发病机制目前尚不明确，女性发病率高于男性，症状反复发作、诊断困难及治疗效果不佳是目前IC的治疗难点。目前临床主要以对症治疗为主[5]。肥大细胞作为一种重要的炎性细胞在各种生理病理过程中都发挥着重要作用，如过敏性哮喘、慢性胃炎、组织的损伤和修复等。IC的一个主要的病理生理学变化即为肥大细胞在膀胱黏膜下层及肌层的活化和聚集。众所周知，肥大细胞可以被激活后脱颗粒释放多种活性物质，如组胺、5-羟色胺、类胰蛋白酶、前列腺素、白三烯、血小板活化因子和细胞因子等[7]，常见的诱发肥大细胞激活的因素有细菌、病毒的某些成分、干扰素等。有研究[8]表明大肠埃希菌属的LPS 可以诱导肥大细胞产生肿瘤坏死因子、IL-6、IL-13、组胺等。

MCP-1可引起肥大细胞的聚集和激活，而且可以被单核细胞、巨噬细胞、内皮细胞及某些肿瘤细胞等多种细胞分泌。MCP-1与CCR2发生特异性的结合，此受体主要分布于单核细胞、髓样前体细胞系和嗜碱性粒细胞中，属于IL-8R家族[3]。MCP-1通过与相应受体结合激活细胞内的信号传导通路， MCP-1活化的信号传导路径因细胞的类型而不同，而路径的差别又可导致细胞趋化活性的不同。MCP-1通过与相应的受体结合后发挥多种生物学功能。有学者[9]在IC的动物模型中发现，IC大鼠的膀胱和尿液中MCP-1蛋白明显增多，肥大细胞表面MCP-1受体CCR2表达增加，并认为CCR2受体可能成为一个潜在的IC治疗靶点。本研究发现，A组小鼠膀胱组织炎性反应较轻，膀胱上皮相对完整。

色甘酸钠作为一种肥大细胞稳定剂被偶然发现。它是一种色酮类化合物[10]，对平滑肌无直接松弛作用，对炎性介质亦无拮抗作用，主要作用在于抑制抗原抗体结合后过敏性介质的释放。色甘酸钠的药理学机制主要是通过与肥大细胞膜上的钙离子通道结合，这样Ca2+的内流受到抑制，从而使MCP-1、组胺、白三烯等多种炎性因子释放减少[11]。研究[12]发现，色甘酸钠可以抑制大鼠肥大细胞脱颗粒释放炎性因子。尽管色甘酸钠的治疗效果在患者中有差异性，而且在哮喘的治疗中只是起到辅助作用，但是还在诸如肥大细胞增多症、过敏性结膜炎等疾病中有着不错的治疗效果。

虽然目前不能完全解释肥大细胞为什么会在IC患者的膀胱中聚集、增殖以及活化脱颗粒，一种可能的解释是损伤的尿路上皮细胞或者其他膀胱内的细胞分泌趋化因子如MCP-1。这些趋化因子进一步导致肥大的迁移以及活化。我们前期研究发现在环磷酰胺小鼠膀胱炎症模型中，MCP-1在尿路上皮、固有层以及平滑肌表达升高，验证了MCP-1对于肥大细胞的趋化作用，并且验证了其对于肥大细胞的激活。本研究中，A组阻断CCR2受体后，尿中组胺、MCP-1的含量较对照组明显下降，因此我们推断，在尿路上皮出现损伤后，释放大量的活性因子，结果引起肥大细胞的聚集和活化，脱颗粒释放更多的细胞因子和炎性因子。这些炎性介质进一步引起肥大细胞的聚集和加重膀胱组织的损伤，从而形成恶性循环。而且在使用肥大细胞稳定剂色甘酸钠治疗IC小鼠后，有效缓解小鼠膀胱的炎症水平。

综上所述，RS102895、色甘酸钠均可减轻IC模型小鼠的炎症反应，其作用机制可能与MCP-1通过与肥大细胞结合、促进组胺释放有关 。但其具体作用机制仍需进一步研究。

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