肝细胞肝癌患者癌组织中Ras相关C3肉毒素底物1、转化生长因子β1表达变化及其意义

黄国林，滕翠芳，罗燕妹，覃贵慧，骆敏，阳洁

(广西医科大学药学院，南宁530021)

我国是全球肝癌发病率最高的国家之一，我国的肝癌发病人数约占全球的55%。70%～90%的原发性肝癌为肝细胞肝癌(HCC)。手术切除是HCC首选治疗方法，术后高转移率和高复发率是导致HCC患者死亡的主要原因[1]。目前HCC转移和复发的机制尚未完全明确。Ras相关的C3肉毒素底物1(Rac1)是Rho样小GTP酶家族中的一员，在调控肿瘤细胞的生长、侵袭、转移等方面具有重要作用[2]。最新研究[3, 4]发现，Rac1与HCC的侵袭、转移及不良预后密切相关。转化生长因子β1(TGF-β1)在乳腺癌、大肠癌等多种肿瘤的发生发展过程中具有双重作用，既可作为肿瘤促进因子也可作为肿瘤抑制因子[5]。目前Rac1与TGF-β1在HCC发生、发展中的作用机制仍不明确。我们观察了HCC组织中Rac1、TGF-β1的表达变化，并分析其与临床病理特征及预后的关系。现将结果报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2010年11月～ 2013年4月间广西医科大学第一附属医院收治的HCC患者73例，其中男64例、女9例；年龄14 ～ 73岁，中位年龄46岁；据TNM分类标准分为Ⅰ级30例、Ⅱ级15例、Ⅲ级28例；25例存在HCC转移。均行HCC切除术，术中保留HCC组织及相应的癌旁组织(距离癌灶>2 cm处的肝组织)，术后病理显示73例份癌旁组织中18例为肝硬化、55例为正常肝组织，全部标本经4%多聚甲醛固定、脱水、常规石蜡包埋后作4 mm连续切片。

1.2 试剂 兔抗人Rac1多克隆抗体购自美国Signalway Antibody(SAB)公司；鼠抗人TGF-β1单克隆抗体购自美国Santa Cruz Biotechnology 公司；HRP鼠兔通用型二抗购自上海长岛生物技术有限公司；DAB显色试剂盒购自福州迈新生物技术开发有限公司。

1.3 HCC癌组织及癌旁正常组织Rac1、TGF-β1检测 采用免疫组化法检测HCC癌组织、癌旁正常组织Rac1、TGF-β1。抗Rac1多克隆抗体及抗TGF-β1单克隆抗体均按1：100稀释。阳性对照为已知阳性切片，阴性对照以PBS代替一抗。切片常规脱蜡至水，以柠檬酸液(pH 6.0)作为修复液，用高压锅热压修复抗原3 min， 过氧化氢(质量分数为3%)处理10 min消除内源性过氧化物酶，PBS冲洗后加一抗于37 ℃孵育1.5 h，PBS冲洗后加二抗于37 ℃孵育30 min，加DAB工作液显色后用苏木素染色1 min、盐酸酒精脱水透明、晾干封片后在光镜下观察。每张切片在光镜下取10个具有代表性的视野，每张切片均由两位病理医师独立观察。判断标准：Rac1和TGF-β1阳性染色均为在细胞质中有黄色颗粒沉着。根据细胞质的染色程度以及染色细胞的百分率来进行评分[6, 7]：基本不着色者计0分，淡黄色者计1分，黄色计2分，棕黄色或棕褐色计3分；Rac1染色细胞百分率<5%计0分，5%～25%计1分，25%～50%计2分，50%～75%计3分，>75%计4分；TGF-β1染色细胞百分率0%计0分，<10%计1分，10%～50%计2分，>50%计3分。将每张切片染色程度得分与染色细胞率得分相乘即为最终分数，分数≤3视为低表达，>3视为高表达。计算Rac1、TGF-β1的阳性表达率(阳性表达例数/总例数)。

1.4 统计学方法 采用SPSS16.0统计软件进行分析。应用GraphPad Prism 6软件进行作图，所得半定量资料用χ2检验，两两之间相关分析用Spearman 相关性分析检验，用Kaplan-Meier生存曲线分析Rac1和TGF-β1共同高表达与HCC预后的相关性并用log-rank法进行检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

HCC组织、癌旁正常组织Rac1的阳性表达率分别为37.0%(27/73)、20.5%(15/73),二者比较，P<0.05；HCC组织、癌旁正常组织TGF-β1的阳性表达率分别为61.6%(45/73)、28.8%(21/73)，二者比较，P<0.05。

Rac1、TGF-β1表达与HCC临床病理参数的关系见表1。Rac1或TGF-β1的表达与HCC患者年龄、性别、Edmondson-Steiner分级、肝硬化、肿瘤囊状浸润、肿瘤结节、血管侵袭及乙肝表面抗原等临床病理特征均无关(P>0.05)。HCC组织TGF-β1的表达与肿瘤直径、血清甲胎蛋白表达、门静脉癌栓、TNM分期、淋巴结转移有关(P均<0.05)Rac1与TGF-β1在HCC中的表达呈正相关(r=0.313，P<0.01)，与单独高表达Rac1或TGF-β1相比，Rac1与TGF-β1的共同高表达与HCC 的TNM分期及转移有关(χ2=12.244，P<0.01；χ2=8.318，P<0.01)。

表1 Rac1和TGF-β1表达与 HCC患者临床病理参数的关系(例)

本研究对35例HCC患者进行随访。kaplan-Meier生存曲线分析结果显示，单独高表达Rac1或TGF-β1的患者与单独低表达Rac1或TGF-β1的患者的中位生存期无统计学差异(P均>0.05)；共同高表达Rac1与TGF-β1的患者较共同低表达Rac1与TGF-β1的患者中位生存期短(χ2=6.225，P<0.05)，另外， Rac1与TGF-β1共同高表达的患者和单独高表达Rac1或TGF-β1的患者的中位生存期无统计学差异(P均>0.05)。

3 讨论

Rho样小GTP酶家族中的Rac1与HCC的发展密切相关。负性调节Rac1活性及其表达，可诱导HCC细胞凋亡，显著抑制HCC生长与转移[8]，并且HCC细胞核中过表达的Rac1与HCC患者的不良预后相关[3]。反之，异常高表达Rac1能够促进HCC细胞的侵袭和迁移[9]。本研究发现，Rac1主要表达于HCC组织的细胞浆，且其表达显著高于癌旁组织，提示胞质中高表达的Rac1可能与HCC的发生发展密切相关。同时，我们将Rac1表达与患者临床病理资料进行统计分析后发现，Rac1在晚期、有转移的HCC组织中的表达明显高于早期、无转移的HCC组织。这些结果表明，HCC胞质中高表达的Rac1与HCC TNM分期以及转移呈正相关。

TGF-β1是TGF-β家族中分布最广泛且含量最丰富的亚型，研究[10]发现，TGF-β1在HCC的发生发展过程中具有促瘤和抑瘤的双重作用，在肿瘤早期TGF-β1可作为一个肿瘤抑制因子，起到抑制肿瘤进展的效果，而在肿瘤晚期，TGF-β1则具有促进肿瘤进展的作用。另外有研究[11]发现，TGF-β1在HCC组织的表达明显高于正常肝组织，联合TGF-β1和ELF检测可有效地进行HCC的预后评估。此外，有研究[12]表明，TGF-β1促进HCC进展的机制为促进肿瘤EMT，从而促进肿瘤细胞的侵袭和转移。

TGF-β1与Rac1两者表达呈正相关；与单独高表达Rac1或TGF-β1相比，Rac1与TGF-β1共同高表达与HCC 的TNM分期及转移呈正相关。Rac1与TGF-β1共同高表达的患者比共同低表达的患者其复发时间更短。这些结果表明，HCC胞质中共同高表达的Rac1和TGF-β1与HCC的恶性进展及不良预后呈正相关。但目前，Rac1与TGF-β1在HCC中共同高表达的机制尚不清楚。Rac1可间接上调肿瘤细胞的TGF-β1表达。Rac1激活Smad2信号通路从而上调TGF-β1介导的促肿瘤细胞转移作用，促进胰腺导管癌细胞的生长和转移[13]。另一方面，TGF-β1也可间接诱导或激活肿瘤细胞的Rac1表达。Binker 等[14]发现，在人胰腺癌细胞中，TGF-β1可直接激活Rac1/ROS/NF-κB信号通路从而诱导Rac1的表达。Hubchak 等[15]研究发现，在人肾系膜细胞中，Rac1可以通过PI3K/Akt信号通路激活TGF-β1，并且用TGF-β1处理人肾系膜细胞5 min后可直接激活Rac1。外加TGF-β1刺激人肝星状细胞LX-2可以促进Rac1的表达，同时外加SMA则可以抑制这一作用[16]。提示Rac1与TGF-β1之间存在互相调控的关系。据此我们推测，Rac1与TGF-β1可能通过Smad2[13]、ROS/NF-κB[14]、PI3K/Akt[15]等一些信号通路而互相激活，从而共同参与HCC恶性进展。但两者之间具体的分子调控机制及与HCC进展之间的关系，还需进一步深入研究。

综上所述，HCC组织中Rac1、TGF-β1均呈高表达。Rac1、TGF-β1共同高表达与HCC的进展及不良预后有关。。

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