栀子苷四种不同给药途径对局造性脑缺血大鼠的药效学观察

陈晓燕 姜雯雯 房春娟

【摘 要】目的：比较栀子苷四种不同给药途径治疗大鼠脑缺血损伤的药效。方法：成年雄性 SD 大鼠，随机分成假手术对照组、模型组、栀子苷组iv给药组、栀子苷im给药组、栀子苷ig组、栀子苷ns给药组。使用血管腔内尼龙线栓塞术造成大鼠持久性大脑中动脉栓塞（PMCAO），制作脑缺血模型，应用TTC染色、免疫组化法、病理超微组织观察综合评价，比较栀子苷不同给药途径的治疗脑缺血疾病的药效。结果：ns给予栀子苷溶液后大鼠体重修复较好，能显著降低脑缺血模型大鼠的脑含水量、脑梗死面积、血清中NOS及MDA的含量，提高血清中SOD的含量，脑组织病理切片观察脑组织坏死及水肿处也有明显改善，与模型组及其它给药组之间存在着显著性差异。结论：ns给予栀子苷后能够显著修复部分脑组织细胞的活性及改善其病理情况。

【关键词】栀子苷；脑缺血损伤；不同给药途径；药效学

Abstract Objective： To compare four different routes of administration Jasminoidin efficacy of treatment of ischemic brain injury. Methods： Adult male SD rats were randomly divided into sham operation group， model group， Geniposide group iv administration group， Geniposide im administration group， Geniposide ig group， Geniposide ns administration group. Use nylon line endovascular embolization in rats caused by persistent middle cerebral artery occlusion （PMCAO）， the production of cerebral ischemia model， applications TTC staining， immunohistochemistry， tissue pathology observed ultrafine comprehensive evaluation， comparison of different routes of

administration Geniposide cerebral ischemic disease treatment efficacy. Results： Ns after the body

weight of rats given Geniposide repair solution is better， can significantly reduce cerebral ischemia in rats brain water content， infarct size， NOS and MDA content in serum， increase in serum SOD， and brain pathology slices of brain tissue necrosis and edema were observed also at a significant improvement， there are significant differences between the administration and the model group and other groups. Conclusion： Ns give Geniposide can significantly repair some brain cell activity and improve their pathology.

Key words： Geniposide； cerebral ischemic injury； different routes of administration； pharmacodynamics

【中图分类号】R969.4 【文献标识码】A 【文章编号】1672-3783（2017）11-03-0-01

我国约有170万人因脑卒中死亡，大多数脑卒中患者发病后会留下瘫痪或其他严重后遗症[1]。脑卒中可分为缺血性和出血性两类，缺血性中风的发病率占到75%-85%，比出血性中风高很多。因此，防御和治疗脑缺血性中风疾病成为当代医学的重点研究对象。许多种药物在临床前研究结果较理想，但应用到临床的结果却不尽人意。所以寻找预防效果好及疗效确切的脑缺血损伤防治药物，仍是我们研究的重要任務。现代医家认为，脑中风可以用清热解毒法进行治疗，清热解毒法能打通人的经络，让人体内的气血津液的均匀分布，同时能营养脑组织。栀子苷为清开灵复方中栀子的有效成分之一，有研究证明[2]栀子苷具有清热去火、凉血解毒的功效，对大鼠脑缺血/再灌注具有一定的保护作用，对脑缺血类疾病有良好的防治作用。

本研究以线栓法复制大鼠脑缺血模型，根据临床上常用的iv、im、ig、ns四种不同给药途径给予栀子苷，检测其脑含水量、脑梗死面积、血清中SOD、NOS及MDA的含量，以及对脑组织病理切片进行观察，比较其不同给药途径的治疗脑缺血损伤的药效优势，为栀子苷临床用药提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物

雄性大鼠90只，每组15只，体重（260±20）g，由江西中医学院实验动物中心提供，合格证号：SCXK（赣）2015-0001，实验期间饲以固体饲料，自由饮水。实验前禁食不禁水）。

1.1.2 药物及试剂

栀子苷（德思特生物科技有限公司，含量96.2%，批号：syz090911）；鱼线：（4-0号，自购于渔具商店）；SOD、MDA、NOS试剂盒（南昌建成生物有限公司）；水合氯醛（上海品纯试剂有限公司）；肝素钠（Solarbio 试剂公司）；TTC：氯化2，4，5—三苯基四氮唑（中国医药上海化学试剂公司生产，批号：20030325）；多聚甲醛（色谱纯，江苏汉邦科技有限公司）；甲醛溶液（汕头市西陇化工厂有限公司）；其余试剂（分析纯，市售）；双蒸水（自制）。

1.1.3 仪器

SIGMA3-18K型高速冷冻离心机（厦门精艺兴业科技有限公司）；722可见分光光度计（上海欣茂仪器有限公司）；WH-2微型旋涡混合仪（上海沪西分析仪器有限公司）；漩涡混合器（上海医科大学仪器厂）；恒温水浴箱（常州国华电器有限公司）；超声清洗器（上海必能信超声有限公司）；超纯净水发生器（美国Miliipore公司）；微量移液器。

2 实验方法

采用线栓法制备脑缺血模型，分别ig、iv、im、ns给予（25mg·mL-1）栀子苷溶液，选用脑含水量及脑梗死面积、SOD、MDA、NOS为评价指标，比较其药效，从而筛选合适的给药途径。

2.1 分组及给药

动物随机分为6组，即假手术组、模型组、栀子苷ig、iv、im、ns组、每组大鼠给三次药，分别是手术前给药一次、术后4小时给第二次、12小時给第三次，24小时后处死大鼠，取脑。

2.2 动物模型的制备

2.2.1 栓子制备

将直径为0.25mm尼龙线切制成等长大约40mm的线段。将尼龙线的一端靠近酒精灯进行烫钝至呈鼓锤状，使其头端光滑圆钝，尖端或不规则状则弃用。取头端直径为0.26-0.30mm的线栓用酒精灭菌，并用0.9%的氯化钠溶液冲洗，肝素浸润后备用。

2.2.2 模型的建立

参照Longa等[3]和罗勇等[4]报道的方法，假手术组只分离CCA、ICA、PPA而不插线结扎。在操作过程中，手术中均需以白炽灯对各组实验大鼠进行加热保温，同时需保持25-28℃的室内温度温。在分离动脉过程中要保护沿着颈外动脉、颈总动脉走行的迷走神经，避免造成气管损伤。否则会使大鼠呼吸道阻塞，严重时窒息死亡。

2.3 标本采集

2.3.1 神经功能缺陷评分

参照longa的评分方法，手术24h后对大鼠进行评分。评分为0与4分的大鼠弃之不用。

2.3.2 血清的采集

大鼠麻醉后，心脏取血，将血放于100×12mm塑料试管中， 4℃冰箱内静放2小时，血液凝固后，离心机离心5min，取上清液血清至EP管中，-20℃冰箱保存待测。

2.3.3 脑梗死面积的测定

大鼠缺血24h后，立即断头处死，取出脑组织。用生理盐水冲洗，将其放置于-20℃的冰箱中冷冻15分钟左右，将其切成2mm左右的切片，将其切片置于2%的TTC生理盐水溶液中，在37℃下孵育约30分钟，后将其铺开并拍照。先用photoshop软件处理图片，再用Osiris 4软件算面积。另取部分大鼠脑组织置于冰盘上，沿大脑中动脉梗死区中心冠状切4mm厚的切片，放于10%福尔马林中固定，备用做病理切片。

2.3.4 脑组织含水量的测定

快速剥出大鼠脑组织。称重，然后置于100℃左右的烘箱内烘干至恒重，将烘干的脑组织进行称重示为干重。按公式计算脑含水量。含水量（%）=（湿重-干重）/湿重×100%。

2.3.5 HE染色

动物深度麻醉后，取其脑组织，将脑组织将其用生理盐水和40g/L的多聚甲醛固定液灌注固定，之后用200g/L蔗糖保存沉底过夜，切片机切片，常规HE染色。

2.4 试剂盒的测定

根据试剂盒说明书进行SOD、NOS及MDA试剂盒的操作，并用722可见分光光度计进行检测。

2.5 统计学处理

运用spss16.0for windows软件进行数据统计分析，实验结果以 表示，采用one Way-ANOVA、Independent Samples Test进行组间比较，采用Excel 2010作图。

3 实验结果

3.1 神经学评分

造模缺血24h后采用Longa的评分方法评分，结果显示假手术对照组：0分；造模缺血组：2-3分；造模组与假手术组比较有极明显的差异（p<0.01）。给药组与模型组比较无明显差异。说明造模成功。

3.2 药效指标考察

栀子苷对大鼠脑缺血/再灌注具有保护作用，能降低脑组织MDA，NOS含量及升高SOD活性。结果见表1。

3.3 不同给药途径的大脑病理切片HE染色图

由图1可看出，脑组织形态学观察光镜下假手术组神经细胞、血管等未见损害性改变；模型组缺血中心区可见神经细胞坏死征象，表现为细胞呈三角形或多角形，细胞固缩深染，核仁消失，细胞胞质浓缩、深染，呈嗜酸性改变，并呈现明显水肿样；Im及ns组细胞形态较模型组有所改善，但局部有点散在毛细血管外渗血；ig组梗死区毛细血管外渗血严重；iv组的缺血区有轻微水肿，细胞核仁保存的较好，可见散在少许神经细胞坏死征象。

4 结论

4.1 流行病学研究表明[5]，雌激素与缺血性脑血管疾病的发生发展有密切关系。也有研究证明，雌激素替代疗法对于脑缺血后的脑损伤有改善作用[6]，故实验应使用雄性大鼠，尽量减少其对药物的干扰。

4.2 本实验对栀子苷在临床上常见的四种给药方式的对脑缺血损伤疾病的药效学进行了研究

4.3 大脑脑缺血后梗死部分细胞会坏死及局部会出现水肿，脑含水及脑梗死面积可以宏观评判脑缺血损伤程度的大小。给予栀子苷后能够修复部分脑组织细胞的活性及减少脑含水量，其脑梗死面积大小顺序为：模型组>ig组>im组>ns组>iv组，脑含水大小为：模型组>ig组>iv组>ns组≈im组，结果可以推测出iv与ns组对于大鼠脑缺血的治疗效果较好。

4.4 脑缺血时，血清中MDA、NOS、NO明显上升（均P<0.01），SOD明显下降（p<0.01），其发生机理可能为脑缺血再灌注时，细胞内钙离子内流从而使细胞内钙离子多，激活了NOS，使NO明显升高。MDA为氧自由基生物膜不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反应的代谢产物，其含量的变化可间接反映组织中氧自由基含量的变化。在脑缺血期间，氧自由基大量生成，MDA升高，SOD活性会明显下降，本试验结果显示栀子苷具有改善脑缺血损伤的作用。其含量大小顺序为：SOD：模型组ig组>im组>ns组>iv组；MDA：模型组>ig组>ns组≈im组>iv组，故可推测出iv给药后对因子的调节作用最强，故可间接说明其药效最好，其次是ns及im组。

综上可看出，栀子苷不同四种给药方式对脑缺血再灌注损伤中的各因子均具有调节作用，且与模型组相比具有显著性差异，故栀子苷用于临床上治疗脑缺血再灌注具有一定的可行性。

参考文献：

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Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，el a1.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats[J].Stoke，1989，20：84-91.

罗勇，董为伟.Wistar大鼠插线法局灶性脑缺血/再灌注模型的实验研究[J].重庆医科大学学报， 2002， 27 （1）： 1-3.

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