E3泛素连接酶PARK2对人脑胶质瘤细胞侵袭与迁移能力的影响

吴珏 裘佳寅 许璐 李锦 陈宁 潘亭亭 田亚平

恶性脑胶质瘤是中枢神经系统最常见、死亡率最高的原发性脑肿瘤，占颅脑肿瘤的40%～50%，严重威胁人类健康[1]。侵袭和迁移行为是胶质瘤细胞的重要特征，脑胶质瘤向正常脑组织周围弥漫性、浸润性生长，手术难以完全切除。因此，探索脑胶质瘤侵袭和迁移的分子机制，寻找其潜在的治疗分子靶点将有重要临床意义。PARK2基因编码的蛋白是一种E3泛素连接酶，参与生物体内蛋白的泛素化修饰，并连接蛋白酶体降解系统，最初是作为常染色体隐性遗传性少年型帕金森病的致病基因而被发现[2-5]。但它在胶质瘤细胞中侵袭迁移的生物学功能和可能的分子机制尚不明确。本研究通过在脑胶质瘤细胞中构建过表达PARK2细胞株，揭示PARK2影响脑胶质瘤细胞的侵袭和迁移作用。

1 材料与方法

1.1 材料和试剂

U138，A172，U251，U373，T98G细胞株均购于ATCC细胞库；DMEM高糖培养基、胎牛血清、DMSO、胰酶等均购于Gibco；PARK2抗体购于CST公司； GAPDH抗体、二抗购于Santa Cruz公司；载体pBABE-puro购于Cell Biolabs Inc公司产品；Matrigel购于Corning公司；Transwell小室购于BD公司。

1.2 稳定过表达细胞株的构建

选用逆转录病毒载体pBABE-puro vector来构建PARK2-WT的稳定过表达细胞系。选择状态良好的细胞，将包装好的逆转录病毒载体pBABE-puro-PARK2病毒液转染到脑胶质瘤细胞中，感染24～48 h后嘌呤霉素筛选阳性克隆3 d，收集以上细胞株的蛋白，进行免疫印迹检测PARK2在这些细胞中的蛋白的表达水平。

1.3 免疫印迹

RIPA蛋白裂解液裂解细胞后，8%聚丙烯酰胺凝胶电泳，转移至硝酸纤维膜上；用含5%脱脂奶粉的TBST 封闭1 h；加入一抗（PARK2、EGFR和GAPDH稀释倍数均为1：5 000），4℃过夜，TBST洗涤3次，每次15 min；分别加二抗（辣根过氧化物酶标记）室温孵育1 h；TBST洗涤3次，每次15 min；ECL显色，医用胶片显影。

1.4 细胞划痕试验

消化细胞种6孔板，具体数量因细胞不同而不同，掌握为过夜能铺满，复孔重复；37℃孵育细胞过夜；第2天6孔板中加入2 ml无抗无血清的培养基37°C孵育细胞过夜；24 h后等细胞长满后，用200 µl 枪头在6孔板上划一个十字，枪头要垂直，不能倾斜，PBS洗细胞3次，去除划下的细胞，加入无血清培养基；放入37度5% CO2培养箱培养，不同时间点拍照。

1.5 Transwell侵袭试验

使用50 mg/l Matrigel 1：8稀释液包被Transwell小室底部膜的上室面，4 ℃风干；制备细胞悬液前，细胞撤血清饥饿12 h；消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，用PBS洗3遍，用含BSA的无血清培养基重悬；取细胞悬液200 µl加入Transwell小室；24孔板下室一般加入500 µl含FBS培养基，常规培养12～48 h；用结晶紫染色，洗脱液洗脱，酶标仪上570 nm 测其OD值。

1.6 统计学分析

各实验独立重复至少3次以上。实验结果采用统计软件SPSS13.0进行处理，两组间比较采用两样本Student’s t检验。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 脑胶质瘤细胞中构建过表达PARK2的稳定细胞株

为研究PARK2对人脑胶质瘤细胞侵袭与迁移能力的影响，我们在体外GBM细胞上分别利用慢病毒载体pCDH-CMV-MCSEF1-copGFP（过程参见材料和方法）上构建了PARK2过表达细胞稳定株，用于研究和观察PARK2对GBM细胞生物学功能的影响。首先，我们确认PARK2在GBM细胞系的表达情况，我们发现A172和U138细胞中蛋白表达水平较高，U373、U251和T98G细胞蛋白表达都较低（图1A）。然后，我们选择在U251和T98G细胞中构建了过表达PARK2稳定株并通过Western-blot确定了细胞稳定株的效果（图1B）。

图1 脑胶质瘤细胞中PARK2的表达和稳定过表达株的蛋白验证；A.PARK2在脑胶质瘤细胞中的表达情况；B.构建PARK2过表达稳定细胞株验证

图2 过表达PARK2对胶质瘤细胞迁移和侵袭能力的影响（P＜0.01）；A.划痕实验检测过表达PARK2对胶质瘤细胞U251迁移能力的影响；B.Transwell 侵袭实验检测过表达PARK2对胶质瘤细胞U251和T98G侵袭能力的影响

2.2 PARK2影响脑胶质瘤细胞迁移和侵袭

我们采用划痕实验和Transwell invasion模型检测PARK2对胶质瘤细胞迁移和侵袭能力的影响。过表达细胞株U251-PARK2稳定株进行划痕实验，经过划痕后连续观察，PARK2过表达组细胞向划痕中央迁移的速度明显减慢，在划痕48 h后对照组的细胞已经接近汇合处，而PARK2过表达组仍有较宽的划痕存在，与转染空载体的对照组相比，过表达U251-PARK2的细胞迁移能力明显低于对照组，如图2所示，实验重复三次且差异有统计学意义（P＜0.01）。接着，PARK2过表达的胶质瘤细胞U251和T98G穿过人工基底膜侵袭到小室底面的细胞相对于对照组明显减少（图2），实验重复三次，差异有统计学意义（P＜0.01）。以上结果表明，过表达PARK2可以抑制胶质瘤细胞的迁移和侵袭能力。

3 讨论

PARK2基因编码的蛋白是一种E3泛素连接酶，参与生物体内蛋白的泛素化修饰，并连接蛋白酶体降解系统。目前研究发现PARK2的功能包括蛋白质反转、应激反应、体内稳态、异源吞噬、新陈代谢、细胞生长和生存等[6-10]。PARK2除广泛存在于人类正常组织中，在多种肿瘤组织，如肺癌、胃癌、宫颈癌、结肠癌、皮肤黑色素瘤等中存在体细胞PARK2失活的参与；PARK2缺失的小鼠可增加肿瘤发生的易感性；敲低PARK2可促进胶质瘤细胞的增殖和肿瘤形成能力，而过表达PARK2可减少在体外或体内各种组织起源的癌细胞的增长，以上都显著表明PARK2的肿瘤抑制作用[11-14]。但是PARK2在肿瘤中侵袭和转移的行为还未曾明确。因此，为进一步研究PARK2在肿瘤中的生物学功能，我们研究选择了五种脑胶质瘤的细胞系检测PARK2的蛋白表达情况，发现了U373、U251、T98G表达量明显低于U138和A172。于是我们选择了U251和T98G细胞构建PARK2野生型的过表达株用于PARK2在胶质瘤细胞中生物学功能的研究。通过在胶质瘤细胞U251和T98G上过表达PARK2观察其对胶质瘤细胞侵袭和转移能力的影响，并寻找可能的机制。通过细胞划痕实验和Transwell侵袭实验，我们发现上调PARK2后细胞的侵袭和迁移能力明显下降。因此，我们发现PARK2在胶质瘤的侵袭和迁移中扮演着重要的角色，是脑胶质瘤侵袭与迁移的重要因子。

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