冬虫夏草对哮喘模型大鼠肺组织NOD1和NOD2表达的影响

蒋珍凤 罗冬娇 童夏生 范广民 王恩智

冬虫夏草富含多糖、氨基酸、脂肪酸、甘露醇及多种微量元素等，具有调节机体免疫、改善糖尿病肾病的病情、诱导肿瘤细胞凋亡等多种作用[1-2]。核苷酸结合寡聚域（nucleotide-binding oligomerization domain，NOD）样受体是模式识别受体的一种，参与细胞内信号传导，在天然免疫系统中起着非常重要的作用，参与机体的抗感染、炎症性肠病、肿瘤等多种疾病的发病机制[3-4]。本研究观察冬虫夏草对哮喘模型大鼠肺组织NOD1和NOD2表达的影响。

1 材料与方法

1.1 材 料 兔抗鼠多克隆NOD2抗体购自biorbyt公司（批号P10336）；Ⅴ级卵白蛋白（OVA）（批号：A5503）购自美国Sigma公司。冬虫夏草150g，购于西藏自治区拉萨正清商贸有限公司，文火煎沸3h，滤出煎液，同前复煎1次，两次液体混匀后（约600mL），4℃冰箱保存备用。

1.2 实验动物及分组 24只清洁级健康雄性SD大鼠[许可证号：SCXK（浙）20140001]，4～5 周龄，平均体质量128g，饲养于杭州师范大学实验动物中心，自由进食和饮水。按照数字表随机分为哮喘组、对照组、冬虫夏草组，每组8只。

1.3 大鼠哮喘模型制备及给药 参照文献[5]，采用OVA致敏的方法复制哮喘模型。冬虫夏草组在OVA雾化激发前一天开始至雾化结束，每天1次给予冬虫夏草5mL/只灌胃[6]，共15天。

1.4 留取肺组织 OVA雾化结束后次日，水合氯醛腹腔注射麻醉，心脏抽血至死。取左肺外缘组织，剪成0.5cm×0.5cm大小块状，液氮保存，实时荧光定量PCR法（qPCR）检测肺组织NOD1和NOD2 mRNA表达量。另取左肺门组织，多聚甲醛固定、切片，HE染色观察肺组织炎症变化，免疫组化法检测NOD2表达量。

1.5 免疫组化SP法检测 阳性细胞胞浆呈棕黄色表达，每张切片随机选择5个视野，Image-pro Plus 5.1免疫组化图像分析系统对阳性细胞进行灰度扫描，取其平均值代表该片的光密度（optical density，OD）值[5]。

1.6 qPCR检测方法检测肺组织NOD1和NOD2 mRNA表达[5]研磨肺组织，Trizol-离心柱法提取总RNA，转录成cDNA。NOD1的上游引物为5’-AGCT AACCTCCTAAGCGGGA-3’，下游引物为 5’-TCGGT GACCAGCAGAAAGAC-3’，产物大小为 348bp；NOD2的上游引物为5’-FCCTTTGAACTGCAAGGGTGC-3’，下游引物为 5’-RGGCAAAGATTCTCCGACCCA-3’，产物大小为396bp；内参β-Actin的上游引物为5’-CCCATCTATGAGGGTTACGC-3’，下游引物为 5’-TTTAATGTCACGCACGATTTC-3’， 产物大小为150bp。结果分析采用比较 CT值法：△△CT=（CTNOD-CTβ-actin） 实验组-（CTNOD-CTβ-actin）对照组，基因相对表达量（RQ值）采用2-△△CT方法计算。

1.7 统计学方法 应用SPSS16.0统计软件，多组间均数比较采用单因素方差分析，两变量相关分析采用直线相关分析法，数据以均数±标准差（±s） 表示，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组哮喘模型大鼠肺组织NOD2蛋白表达比较

阳性细胞主要为气道上皮细胞、淋巴细胞等，其胞浆呈棕黄色表达。哮喘组大鼠肺组织NOD2蛋白的光密度值显著低于对照组（P＜0.01），冬虫夏草组显著高于哮喘组（P＜0.05）。见表 1、封四图 1。

表1 各组哮喘模型大鼠肺组织NOD2表达量比较（±s）

表1 各组哮喘模型大鼠肺组织NOD2表达量比较（±s）

注：与对照组比较，**P＜0.01；与哮喘组比较，△P＜0.05；NOD：核苷酸结合寡聚域

组别对照组哮喘组冬虫夏草组鼠数888 NOD2（OD 值）0.24±0.03 0.18±0.03**0.23±0.02△

2.2 各组哮喘模型大鼠肺组织NOD1和NOD2 mRNA表达比较 抽提物总RNA的A260/A280比值在1.8～2.0之间，目的基因NOD1、NOD2和内参基因β-actin的熔解曲线均为单一峰，基因扩增曲线呈标准S型。哮喘组大鼠肺组织NOD1 mRNA表达量显著低于对照组（P＜0.01）；冬虫夏草组大鼠肺组织NOD1 mRNA表达量显著高于哮喘组（P＜0.01）。哮喘组大鼠肺组织NOD2 mRNA表达量与对照组差异无统计学意义（P＞0.05）；冬虫夏草组大鼠肺组织NOD2 mRNA表达量显著高于哮喘组（P＜0.05）。见表2。

表2 各组哮喘模型大鼠肺组织NOD1和NOD2 mRNA表达量比较（±s）

表2 各组哮喘模型大鼠肺组织NOD1和NOD2 mRNA表达量比较（±s）

注：与对照组比较，**P＜0.01；与哮喘组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01；NOD：核苷酸结合寡聚域

鼠数组别对照组哮喘组冬虫夏草组888 NOD1 RQ 值（2-△△CT）1 0.62±0.34**0.98±0.22△△NOD2 RQ 值（2-△△CT）1 0.92±0.32 1.27±0.48△

2.3 各组哮喘模型大鼠肺组织炎症 HE染色显示，对照组肺组织结构完整、细胞清晰，炎症细胞和支气管腔内分泌物少见；哮喘组见上皮细胞和黏液腺增生，见较多炎性细胞，有些管腔见黏液栓等；冬虫夏草组炎性改变较哮喘组减轻（见封四图2）。

2.4 相关性分析 哮喘模型大鼠肺组织NOD2 mRNA与蛋白表达水平无显著相关性（n=24，r=0.32，P＞0.05）；NOD1 mRNA 与 NOD2 mRNA 表达水平无显著相关性（n=24，r=0.20，P＞0.05）。

3 讨论

模式识别受体包括膜结合受体和细胞内模式识别受体等，前者包括Toll样受体，后者包括NOD样受体。迄今为止，共发现22个NOD样受体家族成员，其中最具代表性的是NOD1和NOD2。NOD样受体分布于细胞胞浆中，可以识别进入细胞内的病原体及其产物，在天然免疫中发挥重要作用。研究[7]发现，NOD样受体与多种肺部炎症性疾病有关，例哮喘、慢性阻塞性肺疾病、肺损伤等，但其机制尚未清楚。

本研究发现，NOD2表达于肺组织的气道上皮细胞、淋巴细胞等，且哮喘组大鼠肺组织NOD2蛋白的表达水平低于对照组（P＜0.01），提示NOD2可能与哮喘的气道炎症密切相关。同时发现哮喘组大鼠NOD2 mRNA的表达量与对照组无差异（P＞0.05）。相关分析表明，大鼠肺组织NOD2 mRNA和蛋白的表达水平无显著相关性（P＞0.05）。相似的结果也见于其他学者的报道，在哮喘大鼠肺组织NOD2蛋白表达下降，认为NOD2表达减弱可能与哮喘气道炎症有关[8]。通过流式细胞术也发现，在哮喘患者趋化因子CCR3阳性的粒细胞中，NOD2表达下降[9]。而在急性发作期哮喘患者外周单个核细胞中，NOD2 mRNA表达量高于慢性持续期哮喘患者且高于健康对照组，认为NOD2 mRNA表达增加促进哮喘炎症并与哮喘严重程度相关[10]。以上研究发现，哮喘NOD2 mRNA表达不一致的原因可能与其表达的组织或细胞不同有关。本研究同时还发现，哮喘组大鼠肺组织NOD1 mRNA 表达水平低于对照组（P＜0.01），提示NOD1 mRNA表达不足可能与哮喘气道炎症有关。通过相关分析发现，NOD1和NOD2 mRNA无显著相关性（P＞0.05），提示NOD家族mRNA水平的改变不具有一致性。

目前认为，NOD1和NOD2的失调与多种炎症性疾病相关，选择性地抑制以它们及其下游区的信号蛋白为靶点可能是治疗疾病的有效方法[11]。冬虫夏草是一种属于中药的免疫调节剂，虫草素是冬虫夏草上的主要活性成分，具有降血脂、抗肿瘤、减轻哮喘症状的功效[12]，但其治疗机制尚未完全清楚。本研究结果显示，冬虫夏草组大鼠肺组织炎症细胞、炎症反应较哮喘组减轻，且冬虫夏草组大鼠NOD2蛋白及mRNA和NOD1 mRNA表达水平高于哮喘组，提示冬虫夏草可能具有上调NOD1和NOD2表达的作用，通过上调模式识别受体的表达起到减轻哮喘气道炎症的作用。相似的研究[13]也发现，虫草多糖能减少哮喘患者气道中炎症细胞的浸润、减轻气道上皮损伤和水肿、降低气道高反应、下调炎症因子的释放。在慢性阻塞性肺疾病中，冬虫夏草具有减轻症状、改善肺功能、提高生存质量、增强心功能等作用，其治疗机制可能通过增强免疫功能、抑制炎症反应和减轻氧化应激反应等[14]。

综上所述，哮喘模型大鼠肺组织NOD1和NOD2的表达下降，冬虫夏草能上调哮喘模型大鼠肺组织NOD1和NOD2的表达，冬虫夏草可能通过上调模式识别受体的水平起到治疗哮喘的作用。

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