结肠癌组织ILK与E-cadherin表达及预后意义

刘 伟 杨 鹏 李于红 洪 琛 罗华立 顾卫军

恶性肿瘤的形成与发展是一个复杂的病理过程，涉及到多个肿瘤基因，多种致癌通路。整合素链接激酶（integrin-linked kinase，ILK）属于丝/苏氨酸蛋白激酶[1]。其在肿瘤形成的相关因素中处于交叉部位，并与恶性肿瘤的发展、侵犯和迁移有着密切的关系。上皮细胞钙黏素（E-cadherin）是一种黏附分子，具有钙依赖性，大多存在于上皮细胞中，主要在同型细胞之间起黏附反应，并在细胞骨架中起重要作用[2]，在维持细胞形态和调节细胞黏附中具有重要作用。研究[3-5]表明，ILK与E-cadherin在多种恶性肿瘤的发生发展中起重要作用。我们采用免疫组织化学方法对结肠癌组织ILK和E-cadherin表达进行检测，探讨ILK及E-cadherin表达水平与结肠癌的临床病理特征的关系。

1 材料与方法

1.1 临床资料 选取2013年—2016年期间于我院施行结肠癌根治性手术的50例标本，均未施行放疗和化疗，25例正常结肠组织标本中有15例选取距离恶性肿瘤边缘至少5cm以上，并经病理证明为正常结肠组织，10例正常结肠组织来自良性疾病结肠部分切除标本。两组数据符合分类变量的统计学处理原则。实验标本采用甲醛溶液固定，所有标本石蜡包埋，标本切片厚度为4μm。50例结肠癌患者中男27例，女23例，年龄44～82岁，中位年龄57岁。肿瘤分化程度：高中分化13例，低分化37例；伴淋巴结转移者22例，无淋巴结转移者28例；按美国肿瘤联合会（AJCC）制定的 Dukes分期法[6]：A+B 期 24例，C+D期26例。

1.2 主要试剂 兔抗人ILK多克隆抗体（批号16B10235）；鼠抗人E-Cadherin单克隆抗体（批号16A10609）购自北京信生元生物医学科技有限公司。SP免疫组化检测试剂盒购自上海研卉生物科技有限公司；DAB显色试剂盒自北京诺博莱德科技有限公司购得。

1.3 免疫组织化学染色方法 确定标本的组织学类型及分化程度行常规HE染色。50例结肠癌及25例结肠正常组织均行抗整合素连接激酶（ILK），抗E-cadherin的免疫组织化学染色，每一个蜡块标本连续切片4～5张，厚约4μL。切片脱蜡，水化后严格按照S-P法试剂盒说明书步骤进行。抗原修复用柠檬酸缓冲液。一抗工作时浓度为1：50。运用DAB显色试剂盒染色，对比染色采用苏木素，封片采用中性树胶。阴性对照采用PBS代替一抗。染色为SP法过氧化物酶标记的碱性磷酸酶染色。

1.4 结果判定 每张病理切片选择约3个高倍视野，在每个视野中由约3个病理科医师计数100个肿瘤细胞。整合素连接激酶（ILK）蛋白在肿瘤细胞浆中染色呈现为黄色或者为棕黄色提示为阳性，根据阳性染色细胞的百分率进行统计:如果百分率≤5%记分为0分，在6%～50%之间记为1分，50%～80%记为2分，＞80%记为3分。阴性评分为0～1分，阳性评分在2～3分之间。E-cadherin蛋白在肿瘤细胞质中染色为棕黄色为表达阳性，无染色提示阴性。采用Gofuku等[7]的判定标准，阳性细胞数＞70%判定为正常表达，＜70%提示表达异常，判定为阳性。

1.5 统计学方法 应SPSS19.0软件，计数资料比较，采用χ2检验。相关性分析采用Spearman检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 结肠癌组织及结肠正常组织ILK和E-cadherin表达情况 ILK在细胞质中出现不同程度染色为黄色颗粒时提示为阳性（封三图1）。结肠癌组ILK表达阳性率 66.0%（33/50），正常结肠组表达阳性率24.0%（6/25）。结肠癌组织ILK表达阳性率明显高于正常结肠组（P＜0.05）。E-cadherin在结肠癌细胞质中出现黄色染色为低表达（封三图2）。结肠癌组E-cadherin表达阳性率42.0%（21/50），正常结肠组表达阳性率96.0%（24/25），结肠癌组织E-cadnerin表达阳性率明显低于正常结肠组（P＜0.05），见表1。

表1 结肠癌组及正常结肠组ILK和E-cadherin表达[例（%）]

2.2 ILK和E-cadherin表达与结肠癌各临床病理因素之间的关系 统计分析显示，ILK表达与结肠癌临床分期及有无淋巴结转移有关（P均＜0.05），与性别、肿瘤大小无关（P＞0.05）；虽然ILK在低分化结肠癌组织表达上调，但高、中、低分化之间差异无统计学意义（P＞0.05）。E-cadherin表达与结肠癌的临床分期、有无淋巴结转移以及结肠癌的分化程度均有关（P均＜0.05），但与肿瘤大小、性别无关（P＞0.05），见表 2。

表2 ILK和E-cadherin表达与各个临床病理因素相关性[例（%）]

2.3 ILK和E-cadherin相关性分析 Spearman相关分析显示，ILK与E-cadherin在结肠癌组织表达呈负相关（r=-0.421，P＜0.05），见表 3。

3 讨论

整合素连接激酶（ILK）是一种含有多个锚蛋白重复序列的丝/苏氨酸蛋白激酶，分子大小为59KD，它的基因定位于染色体11p5.5-11p15.4。ILK可以介导细胞与细胞外基质（ECM）之间的跨膜信号转导过程；可以参与调节控制整合蛋白、并可以参与Wnt等多条信号转导通路。通过以上各种转导方式进而影响细胞的增生、凋亡、细胞黏附和迁移[8]。

表3 ILK和E-cadherin表达相关性

ILK过量表达能够促进一部分依赖性的肿瘤细胞存活。整合素是一种重要的黏附分子，ILK能提高细胞的可运动性，主要是它存在于整合素和肌动蛋白细胞骨架之间这一有利的中间位置，从而促进肿瘤的转移。在活体外，ILK能磷酸化PKB/Akt，激活PKB传导通路，抑制上皮细胞的凋亡。ILK激活是通过黏附到细胞外基质和磷脂酰肌醇（-3）激酶（PI3K）依赖途径的生长因子来实现的，ILK激活促进了细胞的存活并保护抑制了细胞的凋亡。在上皮细胞中ILK的过表达导致了停泊非依赖性细胞的增长，细胞周期的延长，并且增强细胞周期蛋白A的表达，增强了细胞的致瘤性[9]，ILK表达可抑制GSK3的活性，并能增强了转录因子激活蛋白-1（activatorprotein-1，AP-1）的活性，从而导致细胞转移能力的增强，当ILK的高表达时，能够导致基质金属蛋白酶-9（matrixmetalloproteinase-9，MMP-9） 上调，MMP-9 可以通过AP-1转录因子途径。MMP-9表达增加，从而参与生长因子信号通路，这些通路的激活在一定程度上可以降解细胞外基质、促进恶性肿瘤组织中血管的形成；增强了细胞运动，从而促进了恶性肿瘤的淋巴结转移[10]。ILK还能够磷酸化PKB Akt的Ser473，阻碍上皮细胞的凋亡，ILK是可以作用于一些磷酸化的调控元件，这些调控元件位于PKB Akt上游区，这些元件参与一些癌基因与PI3K通路，促进VEGF的表达，VEGF促进血管内皮细胞增殖、从而导致肿瘤血管的生成[11]。研究表明ILK在卵巢癌[12]、非小细胞肺癌[13]、胃癌[14]、乳腺癌[15]、喉鳞状细胞癌[16]的发生发展中具有重要的作用，ILK具有癌基因的特性。本研究结果显示，在50例结肠癌组织ILK的阳性表达率（66.0%）高于正常结肠组（P＜0.05），ILK 蛋白表达水平与临床分期、结肠癌淋巴结转移密切相关（P＜0.05），与结肠癌的分化程度无关（P＞0.05）。结果提示，在结肠癌组织ILK的高表达会刺激结肠癌中某些恶性肿瘤相关因子活化以及某些与恶性肿瘤扩散相关的信号转导通路，进而促进结肠癌的发生，并促进结肠癌的转移及侵袭，提示ILK高表达在结肠癌的转移中起到了一定作用。

E-cadherin基因定位于16q22.1，是一种广泛分布于上皮细胞的钙依赖性细胞黏附分子。E-cadherin作为最重要的黏附分子，其表达异常将导致细胞的聚集、甚至侵袭和转移，从而形成恶性肿瘤。研究[17]表明，在某些恶性肿瘤的组织E-cadherin的丢失导致细胞间接触的减弱，进而导致组织的恶性变及恶性肿瘤细胞的侵袭和转移。本研究结果显示，E-cadherin在正常结肠组织中高表达，而在结肠癌组织中表达率明显降低（P＜0.05）；E-cadherin表达水平与结肠癌临床分期分化程度，结肠癌淋巴结转移相关（P＜0.05），表明随着结肠癌的恶性程度进展加剧，E-cadherin表达也会有所下降，E-cadherin低表达导致细胞之间黏附减弱，从而引起结肠癌细胞发生扩散、转移，提示E-cadherin表达异常与结肠癌的侵袭转移等密切相关，E-cadherin低表达提示患者预后不良。

研究[18]表明，ILK能够激活E-caherin的抑制物S-nail，从而使E-cadherin表达下调、细胞间连接减弱或消失，从而导致恶性肿瘤侵袭性的增加。本实验结果显示，在结肠癌组织ILK表达与E-cadherin表达呈负相关（P＜0.05），这与既往文献报道结果一致[19]。可能的原因为ILK过表达诱导转录因子Snail及ZEB1表达，这个过程是通过磷酸化激活PKB来实现的，从而抑制E-caherin表达，两者的共同反应促进结肠癌的侵犯和迁移、扩散。

总之，ILK及E-cadherin在结肠癌的发生、侵犯、转移中起到积极的作用，两者在结肠癌进展中相互作用。临床上联合检测ILK及E-cadherin有助于评估结肠癌的生物学行为，可能是结肠癌的一个新的诊断和治疗的标志。

图1 ILK在结肠癌组织高表达（HE×200）

图2 E-cadherin在结肠癌组织低表达（HE×200）

［1］ Gao J，Zhu J，Li HY，et al.Small interfering RNA targeting integrin-linked kinase inhibited the growth and induced apoptosis in human bladder cancer cells［J］.Int J Biochem Cell Biol，2011，43（9）：1294-1304.

［2］Du WJ，Liu X，Fan GL，et al.From cell membrane to the nucleus：an emerging role of E-cadherin in gene transcription－al regulation［J］.J Cell Mol Med，2014，18（9）：1712-1719.

［3］童英，刘露，李春东，等.ILK及E-钙黏蛋白的表达在宫颈鳞癌发病中的意义［J］.实用肿瘤学杂志，2011，25（5）：431-436.

［4］许华，李胜水，李秀清，等.原发性胆囊癌中ILK和E-cad的表达及意义［J］.中国肿瘤临床，2013，40（19）：1170-1173.

［5］黄汉，米磊，张斌，等.涎腺腺样囊性癌组织中ILK和E-cadherin 的表达及意义［J］.口腔颌面外科杂志，2011，21（3）：159-162.

［6］曾涛，李伟学，钟敏.结肠癌分期对实施完整结肠系膜切除的应用价值和远期疗效［J］.实用癌症杂志，2016，31（4）：628-631.

［7］ Gofuku J，Shiozaki H，Tsujinaka T，et al.Expression of E-cadherin and alpha-catenin in patients with colorectal carcinoma.Correlationwith cancer invasion and metastasis［J］.Am J Clin Pathol，1999，111（1）：29-37.

［8］ Zhuang X，Lv MX，Zhong ZY，et al.Interplay between intergrin-linked kinase and ribonuclease inhibitor affects growth and metastasis of bladder cancer through signaling ILK pathways［J］.J Exp Clin Cancer Res，2016，35（1）：130.

［9］ D'Amico M，Hulit J，Amanatullah DF，et al.The integrinlinked kinase regulates the cyclin D1 gene through glycogen synthase kinase 3beta and cAMP-responsive element binding protein-dependent pathways［J］.J Biol Chem，2000，275（42）：32649-32657.

［10］ Zhao MJ，Gao Y，Wang LL，et al.Overexpression of Integrin-linked Kinase Promotes Lung Cancer Cell Migration and Invasion via NF-κB-mediated Upregulation of Matrix Metalloproteinase-9［J］.Int J Med Sci，2013，10（8）：995-1002.

［11］Perera PM，Wypasek E，Madhavan S，et al.Mechanical signals control SOX-9，VEGF，and c-Myc expression and cell proliferation during inflammation via integrin-linked kinase，B-Raf，and ERK1/2-dependent signaling in articular chondrocytes［J］.Arthritis Res Ther，2010，12（3）：1-9.

［12］Bruney L，Liu Y，Grisoli A，et al.Integrin-linked kinase activity modulates the pro-metastatic behavior of ovarian cancer cells［J］.Oncotarget，2016，7（16）：21968-21981.

［13］ Zhao XZ，Xu ZY，Wang ZQ，et al.RNA silencing of integrin-linked kinase increases the sensitivity of the A549 lung cancer cell line to cisplatin and promotes its apoptosis［J］.Mol Med Rep，2015，12（1）：960-966.

［14］ Zhao G，Guo LL，Xu JY，et al.Integrin-linked kinase in gastric cancer cell attachment，invasion and tumor growth［J］.World J Gastroenterol，2011，17（30）：3487-3496.

［15］ Pang MF，Siedlik MJ，Han S.Tissue Stiffness and Hypoxia Modulate the Integrin-Linked Kinase ILK to Control Breast CancerStem-like Cells［J］.Cancer Res，2016，76（18）：5277-5287.

［16］Wu PA，Li SS，Tang QL，et al.Clinical significance of integrin-linked kinase in laryngeal squamous cell carcinoma［J］.Auris Nasus Larynx，2017，44（4）：458-463.

［17］ Li LI，Lv Y，Zhang Y.Expression and clinical significance of Oct-4 and E-cad in non-small-cell lung cancer［J］.Oncol Lett，2016，11（1）：234-236.

［18］Schaeffer DF，Assi K，Chan K，et al.Tumor expression of integrin-linked kinase（ILK）correlates with the expression of the E-cadherin repressor snail：an immunohistochemical study in ductal pancreatic adenocarcinoma［J］.Virchows Arch，2010，456（3）：261-268.

［19］ Yu J，Shi R，Zhang D，et al.Expression of integrin-linked kinase in lung squamous cell carcinoma and adenocarcinoma：correlation with E-cadherin expression，tumor microvessel density and clinical outcome［J］.Virchows Arch，2011，458（1）：99-107.