腐植酸发酵肽、枯草芽孢杆菌、嗜酸乳杆菌在海刺参与基围虾混养中的应用

薛德林 柳学成 程贵良 刘志国 王冠颖 战晓燕 胡江春

1 中国科学院沈阳应用生态研究所 沈阳 110016

2 东营海跃生物饲料有限公司 东营 110000

3 辽宁威兰生物技术有限责任公司 沈阳 110032

4 上海农林职业技术学院 上海 201600

腐植酸是一种广泛存在于自然界中结构复杂、功能活跃的混合物。由于腐植酸具有特殊的分子结构和生物学功能，作为饲料添加剂在水产和畜禽养殖上已经有广泛应用[1～9]。

本文对腐植酸、豆粕和玉米浆粉通过微生物发酵生产出的腐植酸发酵肽与枯草芽孢杆菌、嗜酸乳杆菌在海刺参和基围虾混合养殖中的增产效果进行研究，旨在为腐植酸类饲料添加剂的利用及腐植酸类净水剂和微生态制剂的应用提供参考借鉴。

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1 供试菌株

（1）枯草芽孢杆菌（Bacillus Subtilis 2018），从辽宁大连黄海海域底泥中分离得到。

（2）酿酒酵母（Saccharomyces Cerevisiae CICC 1421），从中国工业微生物保藏管理中心购买。

（3）嗜酸乳杆菌（Lactobacillus Acidophilus CICC 6074），从中国工业微生物保藏管理中心购买。

1.1.2 供试原料

（1）腐植酸，从内蒙古霍林河郭勒树艳腐植酸公司定购，腐植酸含量≥60%，细度≤80目，水份≤15%，pH=5.0。

（2）玉米浆粉，山东西王集团有限公司生产，市售，蛋白质含量≥42%，碳水化合物（糖）≥8.0%，总磷含量≥1.0%，灰分≤5.0%，水分≤6.0%，细度≤100目。

1.1.3 供试设备

发酵罐，汇森生物设备（镇江）有限公司生产；固体发酵机组，中国水产科学院上海渔用机械研究所研制生产；低温负压流化床，中国水产科学院上海渔用机械研究所研制生产。

1.1.4 供试苗种

海刺参、基围虾，由山东东营海跃水产生物科技有限公司自繁。

1.2 腐植酸发酵肽产品制备工艺

腐植酸发酵肽产品制备工艺：液体发酵→固体发酵→烘干粉碎→产品保证值检测。

（1）液体发酵工艺过程：1支试管斜面→1000 mL三角摇瓶10瓶（摇床培养24 h）→1 t种子罐（24 h）→10 t发酵罐（36 h）。

将选用的枯草芽孢杆菌、酿酒酵母、嗜酸乳杆菌菌株分别在各自的发酵罐中培养，各发酵罐所选用培养基、发酵条件及发酵结果见表1。

（2）固体发酵工艺过程：3 t旋转蒸球高温高压处理固体发酵物料→物料冷却后与发酵菌液混合→传送带机械铺料→采用流动履带式全自动发酵机组发酵。

固体发酵物料配比：腐植酸40份，豆粕30份，玉米浆粉30份。

发酵菌液配比：枯草芽孢杆菌15份、酿酒酵母15份、嗜酸乳杆菌份15份。

将固体发酵原料与发酵菌液，按照100∶45混合，混匀后，均匀的平铺到流动履带式全自动发酵器上进行100 h发酵。

（3）烘干粉碎过程：传送系统→负压式低温真空流化床→传送系统→大型微粉机械→多级筛过筛→传送系统→成品包装→质检→腐植酸发酵肽产品。

固体发酵完成后对所得产物在负压式低温真空流化床进行烘干，烘干的条件是，进风温度80 ℃，出风温度35 ℃，流化时间12 min，含水量12.0%，粉碎、过筛目数100目。

（4）产品保证值检测：粗蛋白检测按照国家标准GB/T 6432-1994饲料中粗蛋白测定方法[10]进行测定；氨基酸检测按照国家标准GB/T 18246-2000饲料中氨基酸测定方法[11]进行测定；小肽检测按照国家标准GB/T 22492-2008饲料中酸溶蛋白方法[12]进行测定，小肽分子量小于2000道尔顿；抗原检测按照发酵豆粕中抗原蛋白的定性检测方法——sds-PAGE方法[13]进行测定；乳酸检测按照国家标准GB 1886.173-2016中乳酸测定方法[14]进行测定。

表1 枯草芽孢杆菌、酿酒酵母、嗜酸乳杆菌液体发酵所需培养基、发酵条件Tab.1 The culture medium and fermentation conditions of Bacillus Subtilis, Saccharomyces Cerevisiae,Lactobacillus Acidophilus liquid fermentation

1.3 试验设计

1.3.1 海刺参与基围虾大面积混养

试验组1：养殖场2（1200亩），养殖场5（1300亩），养殖场6（1150亩）；腐植酸发酵肽5千克/亩、枯草芽孢杆菌5千克/亩、嗜酸乳杆菌5千克/亩用量，在水温平均达到18 ℃以上后，按潮汐规律，每半月投撒一次；试验期间共应用10次。

试验组2：养殖场1（1000亩），养殖场3（1000亩），养殖场7（1000亩）；腐植酸发酵肽10千克/亩、枯草芽孢杆菌5千克/亩、嗜酸乳杆菌5千克/亩用量，在水温平均达到18 ℃以上后，按潮汐规律，每半月投撒1次；试验期间共应用10次。

对照组：养殖场4（1250亩），养殖场8（1000亩），养殖场9（1100亩）。枯草芽孢杆菌5千克/亩、嗜酸乳杆菌5千克/亩、腐植酸10千克/亩用量，水温平均达到18 ℃以上后，按潮汐规律，每半月投撒一次；试验期间共应用10次。

1.3.2 海刺参大面积养殖

试验组：腐植酸发酵肽按照10%剂量拌入海刺参饵料中，枯草芽孢杆菌5千克/亩、嗜酸乳杆菌5千克/亩，在水温平均达到18 ℃以上，按潮汐规律，试验期应用2次。

对照组：腐植酸按照10%剂量拌入海泥中，枯草芽孢杆菌5千克/亩、嗜酸乳杆菌5千克/亩，在水温平均达到18 ℃以上，按潮汐规律，试验期应用2次。

1.3.3 基围虾大面积养殖

试验组：腐植酸发酵肽按照10%剂量拌入基围虾饵料中，枯草芽孢杆菌5千克/亩、嗜酸乳杆菌5千克/亩，水温平均达到18 ℃以上，按潮汐规律，试验期应用2次。

对照组：腐植酸按照10%剂量拌入海泥中，枯草芽孢杆菌5千克/亩、嗜酸乳杆菌5千克/亩，在水温平均达到18 ℃以上，按潮汐规律，试验期共应用2次。

1.3.4 试验时间、地点、管理及经济效益分析

试验时间：海刺参与基围虾大面积混合养殖是2017年5月1日—11月1日，为期180天；海刺参大面积养殖是2017年5月10日—6月10日，为期30天；基围虾大面积养殖是2017年8月1日—10月1日，为期60天。

试验地点：山东东营海跃水产生物科技有限公司养殖场。

日常管理：按照试验设计投撒腐植酸发酵肽和微生物制剂，巡塘、换水、灭草等项管理措施，按照正常管理进行。在山东东营地区海刺参最佳生长时间为4月15日—6月15日、9月1日到11月1日。海刺参最适生长温度为20±5 ℃，25 ℃以上高水温期有夏眠习性。

饲料报酬率：也称耗料增重比、料重比、料肉比、饲料消耗比。即每生产单位重量的产品所耗用饲料的数量。

经济效益分析：按照经济效益计算公式，试验净效益=试验增加收入－试验投入费用。

试验增加费用：腐植酸发酵肽、腐植酸、枯草芽孢杆菌、嗜酸乳杆菌所投入费用。

2 结果与分析

2.1 腐植酸发酵肽的生产

2.1.1 液体发酵

按照表1选用的培养基、发酵条件，经过36 h的发酵，生产出枯草芽孢杆菌≥2×1010个/毫升、酿酒酵母≥3×109个/毫升、嗜酸乳杆菌≥8×109个/毫升的菌液。

2.1.2 固体发酵

经固体发酵得到含水量≤10%、枯草芽孢杆菌≥6×1010个/毫升、酿酒酵母≥1.5×109个/毫升、嗜酸乳杆菌≥2.5×109个/毫升的腐植酸发酵肽。

2.1.3 腐植酸发酵肽的产品保证值

通过上述工艺生产出的腐植酸发酵肽的产品，其产品与腐植酸有区别，通过产品保证值检测，结果见表2。

表2 腐植酸发酵肽与腐植酸的区别及其产品保证Tab.2 The difference of humic acid fermentation peptide with humic acid and its products guarantee value

2.2 腐植酸发酵肽、枯草芽孢杆菌、嗜酸乳杆菌在

海刺参与基围虾大面积混养中的应用

腐植酸发酵肽、枯草芽孢杆菌、嗜酸乳杆菌对海刺参基围虾混养中成活率及产量的影响结果，见表3。

经方差分析海刺参重量：试验组1与对照组比较：P=0.0203，0.01≤P≤0.05，差异显著；试验组2与对照组比较：P=0.0088，P≤0.01，差异极显著；试验组1与试验组2比较：P=0.0203，0.01≤P≤0.05，差异显著。

经方差分析基围虾重量：试验组1与对照组比较：P=0.0467，0.01≤P≤0.05，差异显著；试验组2与对照组比较：P=0.0021，P≤0.01，差异极显著；试验组1与试验组2比较：P=0.0438，0.01≤P≤0.05，差异显著。

腐植酸发酵肽、枯草芽孢杆菌、嗜酸乳杆菌在海刺参与基围虾混养中的应用结果，通过表3可以看出，试验组1海刺参平均196.9千克/亩，基围虾平均17.5千克/亩；试验组2海刺参平均206.1千克/亩，基围虾平均19.6千克/亩；对照组海刺参平均160.4千克/亩，基围虾平均15.6千克/亩。与对照组相比，试验组1海刺参增重率22.76%，基围虾增重率12.18%；试验组2海刺参增重率28.49%，基围虾增重率25.64%。

腐植酸发酵肽、枯草芽孢杆菌、嗜酸乳杆菌在海刺参与基围虾混养中的经济效益分析结果见表4。可以看出，试验组1投入成本增加400元/亩，试验增加收入3880元/亩，净收益增加3480元/亩；试验组2投入成本增加900元/亩，试验增加收入 4950元/亩，试验净收益增加4050元/亩。

表3 腐植酸发酵肽、枯草芽孢杆菌、嗜酸乳杆菌对海刺参、基围虾混养成活率及产量的影响（春秋2季）Tab.3 Effects of humic acid fermented peptide, Bacillus Subtilis and Lactobacillus Acidophilus on survival rate and yield of sea cucumbers and shrimps mixed breeding (spring and fall)

表4 腐植酸发酵肽、枯草芽孢杆菌、嗜酸乳杆菌在海刺参、基围虾混养中的经济效益分析Tab.4 The economic benef i t analysis of humic acid fermented peptide, Bacillus Subtilis and Lactobacillus Acidophilus on sea cucumbers and shrimps mixed breeding

2.3 腐植酸发酵肽、枯草芽孢杆菌、嗜酸乳杆菌在海刺参大面积养殖中的应用

腐植酸发酵肽、枯草芽孢杆菌、嗜酸乳杆菌在海刺参养殖中对海刺参成活率及增重的影响，试验结果及其数据分析见表5。

经过方差分析：试验组与对照组比较，P=0.0092，P≤0.01，差异极显著。

通过表5可以看出，在海刺参大面积养殖中，试验组增重量39.3千克/亩、成活率52.08%、饲料报酬率1.102；对照组增重量27.1千克/亩、成活率45.41%、饲料报酬率1.600。与对照组相比，试验组海刺参增重率45.02%、成活率提高6.67个百分点，饲料报酬率降低0.498。

腐植酸发酵肽、枯草芽孢杆菌、嗜酸乳杆菌在海刺参大面积养殖的经济效益分析见表6。

通过表6可以看出，试验组投入成本增加180元/亩，收入增加1220元/亩，试验增加净收益1040元/亩。（投入的海刺参饵料100元没有计入到投入费用中）。

2.4 腐植酸发酵肽、枯草芽孢杆菌、嗜酸乳杆菌在

基围虾大面积养殖中的应用

腐植酸发酵肽、枯草芽孢杆菌、嗜酸乳杆菌对基围虾成活率及增重影响，试验结果及其数据分析见表7。

经过方差分析：试验组与对照组比较：P=0.0065，P≤0.01，差异极显著。

通过表7可以看出，在基围虾大面积养殖中，试验组增重量18.5千克/亩、成活率44.7%、饲料报酬率0.720；对照组增重量14.2千克/亩、成活率20.3%、饲料报酬率0.941。与对照组相比，试验组基围虾增重率30.28%、成活率提高24.4个百分点，饲料报酬率（FCR）降低0.221。

腐植酸发酵肽、枯草芽孢杆菌、嗜酸乳杆菌在基围虾大面积养殖的经济效益分析结果见8。

通过表8可以看出，试验组1投入成本增加180元/亩，收入增加430元/亩，试验增加净收益250元/亩。（投入的基围虾饵料50元没有计入到投入费用中）。

表5 腐植酸发酵肽、枯草芽孢杆菌、嗜酸乳杆菌对海刺参成活率及增重的影响（30天）Tab.5 Effects of humic acid fermented peptide, Bacillus Subtilis and Lactobacillus Acidophilus on survival rate and weight of sea cucumbers (30 days)

表6 腐植酸发酵肽、枯草芽孢杆菌、嗜酸乳杆菌在海刺参养殖中经济效益分析Tab.6 The economic benef i t analysis of humic acid fermented peptide, Bacillus Subtilis and Lactobacillus Acidophilus in sea cucumbers breeding

表7 腐植酸发酵肽、枯草芽孢杆菌、嗜酸乳杆菌对基围虾成活率及增重的影响（60天）Tab.7 Effects of humic acid fermented peptide, Bacillus Subtilis and Lactobacillus Acidophilus on survival rate and weight of shrimps (60 days)

表8 腐植酸发酵肽、枯草芽孢杆菌、嗜酸乳杆菌在基围虾养殖中的经济效益分析Tab.8 The economic benef i t analysis of humic acid fermented peptide, Bacillus Subtilis and Lactobacillus Acidophilus in shrimps breeding

3 结论

（1）腐植酸是一种存在于自然界中结构复杂功能活跃的混合物，泥炭腐植酸中存在少量的蛋白质、氨基酸和小肽，而矿源腐植酸中没有。腐植酸作为饲料添加剂主要是利用其具有的特殊分子结构和生物活性物质。将腐植酸、豆粕、玉米浆粉按3∶4∶3比例混合，以枯草芽孢杆菌、酿酒酵母、嗜酸乳杆菌为发酵菌种，经液体制菌、固体发酵、低温烘干、微粉碎等生产工艺，得到的腐植酸发酵肽，其主要物理性状、化学性质和微生物含量测定指标：蛋白质38%，小肽10%，赖氨酸3.0%，细度≤100目，含水量≤10%，枯草芽孢杆菌≥6×109个/毫升，酿酒酵母≥1.5×109个/毫升，嗜酸乳杆菌≥2.5×109个/毫升。

（2）腐植酸发酵肽、枯草芽孢杆菌和嗜酸乳杆菌在海刺参与基围虾大面积混养中进行应用试验，结果表明：海刺参增重率22.76%～28.49%，基围虾增重率12.18%～25.64%；试验净收益增加3480～4050元/亩；海刺参大面积养殖中，试验结果表明：海刺参增重率45.02%、成活率提高6.67个百分点，饲料报酬率（FCR）降低0.498，试验净收益增加1040元/亩。基围虾大面积养殖中，试验结果表明：基围虾增重率30.28%、成活率提高24.4个百分点，饲料报酬率（FCR）降低0.221，试验净收益增加250元/亩。从经济效益分析中可以看出，在海刺参与基围虾大面积混养中，应用腐植酸发酵肽、枯草芽孢杆菌和嗜酸乳杆菌，经济效益增加最多，海刺参大面积养殖次之。

（3）腐植酸发酵肽和枯草芽孢杆菌、嗜酸乳杆菌，作为生物饲料添加剂，可为海刺参与基围虾提供小分子的多肽、氨基酸和氮素营养，可以降低养殖水体中的铵态氮、硝态氮、亚硝酸盐、硫化氢等有毒有害物质的浓度，有效地清除池底积累的残余饵料和排泄废弃物，有效地改善水质。并能促进单细胞微藻的生长，调节藻菌相，降低透明度，抑制光合作用，从而控制多细胞大型澡类的生长，结合枯草芽孢杆菌能分泌蛋白酶等酶类，可起到控草作用，使养殖水体形成一个良性生态循环体系。

综上所述，腐植酸发酵肽和枯草芽孢杆菌、嗜酸乳杆菌，作为绿色环保型生物饲料添加剂在海刺参与基围虾大面积混养中应用潜力巨大，经济效益显著，作为绿色环保型饲料添加剂广泛推广应用，必将对我国水产养殖业作出重要贡献。

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