NOX-4调控PI3K信号通路参与TGF-β1诱导肺癌细胞表达I型胶原蛋白*

董 年，余垭妮，吴登敏，王蓓蓓，应赵建，裘丹萍，董 莉，陈成水

(温州医科大学附属第一医院呼吸与危重症医学科， 浙江 温州 325000)

肿瘤微环境由间质细胞和细胞外基质(extracellular matrix，ECM)共同构成，在肿瘤的免疫逃避、浸润转移和化疗耐药等恶性生物学行为方面发挥了重要作用,是肺癌5年生存率居高不下的原因之一[1]。目前肺癌的肿瘤微环境中细胞外基质胶原蛋白和纤连蛋白异常沉积的调控机制尚未阐明。既往研究认为肿瘤微环境中间质细胞尤其是成纤维细胞的活化是ECM异常沉积的中心环节，目前逐渐认识到肺癌细胞可以直接参与ECM的合成和分泌[2]。已知转化生长因子β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)可以经调控PI3K等信号通路参与肿瘤细胞ECM的合成分泌，深入研究TGF-β1调控PI3K信号通路的分子机制可以从肿瘤微环境的角度挖掘肿瘤防治的潜在靶点。NADPH氧化酶(NADPH oxidase, NOX)是一组具有氧化活性的蛋白，包括NOX-1、NOX-2、NOX-3和NOX-4等，主要经产生活性氧簇(reactive oxygen species, ROS)参与细胞的增殖、分化和凋亡，并参与ECM合成和分泌等生物学功能[3]。研究报道NOX-4在肺癌组织中相较于癌旁组织过高表达，过高表达的NOX-4与肿瘤细胞的侵袭转移等恶性生物学行为密切相关[4]，然而关于其在恶性肺癌细胞ECM异常分泌的机制尚未阐明。结合我们之前的研究发现脂酰肌醇3-激酶(phosphatylinositol 3-kinase，PI3K)家族PIK3CD亚基的异常表达和PI3K信号通路的过度激活与ECM异常沉积密切相关[5-6]，本研究拟在研究NOX-4是否参与TGF-β1诱导肺癌细胞 I型胶原蛋白(collagen type I, collagen I)表达的基础上，深入探讨NOX-4是否调控PIK3CD的表达和PI3K信号通路的活化以寻找TGF-β1/PI3K轴潜在的中介蛋白，为肺癌ECM异常沉积揭示潜在靶点。

材 料 和 方 法

1 细胞

人肺癌细胞株A549购于上海中科院细胞库。

2 主要试剂

RPMI-1640培养基和胎牛血清购自Gibco；人重组TGF-β1购自PeproTech；NOX-4抑制剂二亚苯基碘鎓(diphenyleneiodonium, DPI)购自Sigma；BCA蛋白浓度测定试剂盒、预染蛋白Marker和ECL 发光液购自Thermo；兔抗人p-Akt和Akt单抗购自CST；兔抗人NOX-4和collagen I单抗购自Abcam；TRIzol购自Invitrogen；cDNA逆转录试剂盒购自TaKaRa；其它生化试剂购自上海生工生物工程公司。Real-time PCR引物由上海生工生物工程公司设计合成，见表1。

表1 Real-time PCR引物序列Table 1. The sequences of the primers for real-time PCR

3 方法

3.1细胞培养 A549细胞株使用包含10%胎牛血清和1%双抗的RPMI-1640培养基于37 ℃、5% CO2恒温培养箱中培养。

3.2细胞干预 取生长状态良好处于对数生长期的细胞，接种于12孔板(抽提RNA)和6孔板(抽提蛋白)，待细胞长至孔板面积80%时，进行分组干预，每个分组设立3个复孔，每个实验重复3次。

3.3Real-time PCR实验 按照TRIzol说明书提取细胞总RNA，分光光度法测定计算提取的总RNA含量及浓度。取总RNA 2 μg反转录为cDNA，再以适量cDNA为模板进行real-time PCR实验。PCR反应条件为95 ℃10 min;95 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，共40个循环。结果以GAPDH为内参照，对目的基因进行相对定量，用2-ΔΔCt法计算。

3.4Western blot实验 收集各组细胞，提取总蛋白，BCA测蛋白浓度。每组取30 μg蛋白行SDS-PAGE，湿转至PVDF膜，5%脱脂牛奶室温下封闭2 h， I抗(1∶1 000)4 ℃孵育过夜，TBST缓冲液洗膜3次,每次10 min，II抗(1∶5 000)室温孵育1.5 h，再用TBST缓冲液洗膜3次,每次10 min，ECL化学发光法显影。以GAPDH为内参照，结果以各蛋白与GAPDH灰度值比值表示。

4 统计学处理

使用SPSS 20.0统计软件进行统计分析。数据均以均数±标准差(mean±SD)，多组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，组间两两比较采用Bonferroni校正的t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 TGF-β1诱导肺癌细胞中NOX-4和collagen I的表达

选取5 μg/L的TGF-β1刺激A549细胞，于不同时点检测NOX家族和collagen家族的mRNA表达；根据real-time PCR结果，选取不同浓度的TGF-β1刺激A549 细胞48 h，Western blot法检测Nox-4和collagen I蛋白的表达。结果显示TGF-β1可以诱导NOX家族中的NOX-4和collagen家族中的collagen I的表达，呈浓度和时间依赖性升高，其中5 μg/L TGF-β1是最适刺激浓度，TGF-β1刺激48 h后collagen I升高最为显著，差异有统计学意义(P<0.05)，见图1。

Figure 1. The expression of NOX-4 and collagen I in A549 cells induced by TGF-β1. A: the mRNA expression of NOX family and collagen family induced by TGF-β1 (5 μg/L) for the indicated time; B: the protein level of NOX-4 and collagenⅠchanged by the vehicle and TGF-β1 at different doses for 48 h. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vs0 h group;△P<0.05;△△P<0.01vs0 μg/L group.

图1TGF-β1诱导肺癌细胞中NOX-4和collagenI的表达

2 抑制NOX-4部分逆转TGF-β1诱导的collagen I表达升高

使用不同浓度的NOX-4抑制剂DPI预处理A549细胞，再使用5 μg/L TGF-β1刺激48 h，real-time PCR和Western blot结果可见NOX-4抑制剂DPI可以部分逆转TGF-β1诱导的A549细胞中collagen I的表达(P<0.05)，见图2。

3 TGF-β1诱导PI3K 催化亚基PI3KCD表达和PI3K信号通路活化

选取5 μg/L浓度的TGF-β1刺激A549细胞不同时间，Western blot法检测发现TGF-β1可以激活PI3K信号通路，呈现时间依赖性,见图3A; real-time PCR检测发现TGF-β1诱导PIK3 class I亚基中PIK3CD的表达，呈现时间依赖性,见图3B。

Figure 2. Inhibition of NOX-4 blocked TGF-β1-induced expression of collagen I. A: the mRNA expression of collagen I was measured after incubation with NOX-4 inhibitor DPI at different doses with TGF-β1 (5 μg/L) for 48 h; B: the protein level of collagen I was measured after incubation with NOX-4 inhibitor DPI at optimal 5 μmol/L with TGF-β1 (5 μg/L) for 48 h. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group;++P<0.01vsTGF-β1 group.

图2抑制NOX-4部分逆转TGF-β1诱导的collagenI表达升高

Figure 3. TGF-β1 induced PI3K/Akt signaling pathway activation and up-regulated the expression of PIK3CD. A: the protein levels of Akt and p-Akt challenged with TGF-β1 (5 μg/L) for the indicated time; B: the mRNA of PIK3 class I catalytic subunits induced by TGF-β1 (5 μg/L) for the indicated time. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

图3TGF-β1诱导PI3K催化亚基PIK3CD表达和PI3K信号通路活化

4 抑制NOX-4降低TGF-β1诱导PI3K信号通路的活化程度

选取适宜浓度(5 μmol/L)的NOX-4抑制剂DPI预先处理A549细胞，再使用5 μg/L TGF-β1刺激不同时间，real-time PCR和Western blot检测PIK3CD亚基和PI3K信号通路活化情况。结果所示,抑制NOX-4并不影响TGF-β1诱导的PIK3CD表达，但可以干扰TGF-β1活化PI3K信号通路，差异有统计学意义(P<0.05)，见图4。

讨 论

既往认为肿瘤微环境中间质细胞尤其是成纤维细胞的活化是ECM异常沉积的中心环节[7]，NADPH氧化酶与ECM异常沉积的相关研究主要集中在成纤维细胞。Tobar等[8]报道JNK信号通路调控NOX-4来源的ROS参与乳腺癌基质细胞的成纤维细胞样分化和肿瘤纤维化生;类似的是，Hanley等[9]发现抑制NOX-4可以降低肿瘤间质中肌成纤维细胞表型的间质细胞比例。不同于之前研究聚焦于间质细胞,我们选取了TGF-β1诱导肺癌细胞表达 collagen I的细胞模型来模拟肺癌细胞分泌胞外基质的病理生理过程，发现TGF-β1在诱导collagen I表达的同时伴随NOX-4的过高表达，而抑制NOX-4部分逆转TGF-β1诱导的collagen I表达升高，说明NOX-4可能参与TGF-β1诱导肺癌细胞 collagen I表达。与我们的研究类似，Hiraga等[10]报道NOX-4参与TGF-β1诱导胰腺肿瘤的上皮间质变过程。

Figure 4. Inhibition of NOX-4 attenuated TGF-β1-induced PI3K signaling pathway activation. A: the mRNA of PIK3CD was measured after incubation with NOX-4 inhibitor DPI at optimal 5 μmol/L and TGF-β1 (5 μg/L) for 48 h; B: the protein levels of Akt and p-Akt challenged with NOX-4 inhibitor DPI at optimal 5 μmol/L and TGF-β1 (5 μg/L) for 30 min. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group;++P<0.01vsTGF-β1 group.

图4抑制NOX-4降低TGF-β1诱导PI3K信号通路的活化程度

TGF-β1是公认的促纤维化因子，主要经经典的Smad信号通路和非经典Smad信号通路介导ECM中collagen和纤连蛋白(fibronectin)等蛋白的合成分泌[11],其中非经典Smad通路PI3K信号通路是研究热点，已有研究报道抑制NOX-4后胰腺癌细胞经调控PI3K信号通路促进细胞自噬[12]。无论是PI3K class I催化亚基(包括PIK3CA、PIK3CB、PIK3CD和PIK3CG)的异常表达还是PI3K信号通路的过度激活皆与胞外基质的合成分泌密切相关[5-6]，是否NOX-4可以经影响PI3K相关途径逆转TGF-β1诱导的collagen I表达？我们发现TGF-β1在诱导肺癌细胞collagen I表达的同时可以诱导PIK3CD的表达和PI3K信号通路的活化，而抑制NOX-4并不影响TGF-β1诱导的PIK3CD表达却可以降低TGF-β1诱导PI3K信号通路的活化程度，说明NOX-4主要经影响PI3K信号通路的活化参与collagen I的表达调控。与此同时Zhang等[13]发现过表达NOX-4可以显著促进PI3K信号通路活化，而抑制PI3K信号通路可以降低NOX-4的表达。以上研究不仅从正反两面论证了NOX-4是PI3K信号通路活化的中介蛋白，而且揭示NOX-4和PI3K信号通路之间的正向反馈作用共同促进了肺癌细胞的增殖、迁徙和ECM合成、分泌。

虽然我们研究初步揭示了NOX-4调控PI3K信号通路参与TGF-β1诱导肺癌细胞表达collagen I的分子机制，然而研究尚存不足。首先，NOX-4属于NADPH氧化酶家族，主要经释放ROS发挥病理生理作用[14]，本研究中并未阐明TGF-β1/NOX-4/ROS/PI3K轴之间的直接线性关系；其次，NOX-4可以激活Ras/ERK、JNK以及PI3K等众多信号通路[15]，抑制NOX-4部分逆转TGF-β1诱导的collagen I表达升高并不是简单的经降低TGF-β1诱导PI3K信号通路的活化程度，以后的研究势必聚焦多条信号通路之间的协同/拮抗作用；然后，我们研究中仅仅选取了一个代表性的肺癌细胞系，考虑到实验的可靠性，以后势必要在多种肺癌细胞系进行验证。

总而言之，我们研究发现NOX-4调控PI3K信号通路参与TGF-β1诱导肺癌细胞表达collagen I，初步阐述了TGF-β1/NOX-4/PI3K轴在调控肺癌细胞collagen I表达中的分子机制，NOX-4中介蛋白可能是未来针对肺癌ECM过度沉积的干预靶点之一，从肿瘤微环境的视角为肺癌的防治提供新的思路。

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