普洱茶中黄曲霉毒素的研究

◎ 蔡双福，陈晓嘉，陈敏婷，钟舒洁

（1.广东省食品质量监督检验站,广东 广州 510308；

2.广东省食品工业公共实验室，广东 广州 510308；

3.广东省食品工业研究所有限公司，广东 广州 510308）

黄曲霉毒素（Aflatoxins，AFT）属真菌毒素，是由黄曲霉菌和寄生曲霉菌所产生的一类次生代谢产物[1]，可引起肝脏、肾脏等多种组织器官损伤，具有致癌、致畸、致细胞突变的作用，被联合国粮农组织和世界卫生组织认定为Ⅰ类致癌物质，严重危害人、畜、禽类健康[2]。GB 2761-2011《食品安全国家标准 食品中真菌毒素限量》中规定[3]，食品黄曲霉毒素的限量范围特殊膳食用食品≤0.5 μg/kg，其他食品≤5 μg/kg，则认为此类食品对人类不产生较大风险。

普洱茶是以地理标志保护范围内的云南大叶种晒青茶为原料，并采用特定的加工工艺制成，具有独特品质特征的茶叶[4]。普洱茶的仓储陈化是普洱茶生产不可缺少的环节，而储存过程又易受到霉菌的污染，以致近年来大家讨论普洱茶受霉菌污染产生黄曲霉毒素，易致癌等报道在业界引起了广泛关注[5-9]。针对这一问题，结合前人所进行的研究，本文通过容易受黄曲霉污染产生黄曲霉毒素的花生粉作为对照组，对室温条件、高温高湿条件、自然条件污染下与接种产毒黄曲霉进行保存实验，检测保存过程中黄曲霉和黑曲霉的含量。同时采用常规快速法酶联免疫吸附法（ELISA）和先进可靠的检测方法高效液相法（HPLC）和超高效液相色谱质谱法（LC-MS/MS）对黄曲霉毒素进行检测，分析不同实验组黄曲霉毒素的变化情况及不同方法结果差异情况。全面解释普洱茶是否容易产生黄曲霉毒素，为普洱茶安全生产、消费者的担忧提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 产毒菌种

黄曲霉（A. flavus）CICC 2219，来自于中国工业微生物菌种保藏管理中心。

1.1.2 实验样品

市场出售的中低档普洱茶茶叶各2批次，其中生普洱、熟普洱各2批，实验前打成较小颗粒，易于霉菌菌丝进入及黄曲霉毒素的提取；花生粉（市售花生米自制成过细粉灭菌）。分别进行编号：“生1”为中档生普洱，“生2”为低档生普洱，“熟1”为中档熟生普洱，“熟2”为低档熟普洱，“花1”为花生粉。

1.1.3 试剂

黄曲霉毒素ELISA试剂盒（美国Romer Labs公司）、免疫亲和柱（美国Romer Labs公司）。PDA培养基（北京陆桥）。

标物：黄曲霉毒素混标（纯度98%，美国O2SI公司）、黄曲霉毒素B1内标法标物（纯度99%，SIGMA-ALDRICH）、黄曲霉毒素B2内标法标物（纯度99.0%，SIGMA-ALDRICH）、黄曲霉毒素G1内标法标物[纯度（99±1）%，ROMER]、黄曲霉毒素G2内标法标物（纯度99%，SIGMA-ALDRICH）。

液相色谱法试剂：甲醇（色谱纯，honeywell）、乙腈（色谱纯，honeywell）。

LC-MS/MS试剂：甲醇（色谱纯，honeywell），乙腈（色谱纯，默克）。

1.1.4 仪器设备

高效液相色谱仪Agilent 1200使用 FLD检测器（美国Agilent公司）、Triple Quad 3500超高液相质谱联用仪（美国AB SCIEX公司）、Vector PCX柱后衍生器（美国Pickering公司）、Turbo Vap LV 50位自动氮吹浓缩仪（瑞典Biotage公司）、RT-6000酶标仪（德国IFP公司）、AC2-4S1生物安全柜（ESCO公司）、ML204电子分析天平[梅特勒-托利多（上海）有限公司]、MJ-250-Ⅱ恒温恒湿培养箱（上海一恒）。

1.2 实验方法

1.2.1 菌液制备

将黄曲霉产毒菌株CICC 2219接种到PDA培养基斜面上，28 ℃活化培养5 d，转接第二代于相同条件培养7 d，用接种环挑取一定量接入0.85%生理盐水，用移液管反复吹吸混匀，以血球计数板计数，使孢子浓度达到106CFU/mL，用于人工接种模拟黄曲霉污染。

1.2.2 茶叶样品的模拟存放

将茶叶及花生粉分成A、B、C、D共4组，每组每份100 g。①A组模拟未接种黄曲霉室温存放：温度25 ℃、自然湿度。②B组模拟接种黄曲霉后室温存放：温度25 ℃、自然湿度，喷洒2 mL上述1.2.1中菌液。③C组模拟产毒条件未接种黄曲霉高温高湿存放：样品喷洒20 mL无菌水，温度30 ℃、湿度85%。④D组模拟产毒条件接种黄曲霉后高温高湿存放：样品喷洒20 mL无菌水，温度30 ℃、湿度85%，喷洒2 mL上述1.2.1中菌液。以上4组同时存放15 d、30 d、60 d，分别进行黄曲霉毒素的检测。

1.2.3 茶叶中霉菌的测定

按GB 4789-2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 霉菌和酵母计数》[10]。

1.2.4 高效液相色谱法（HPLC法）

（1）样品前处理过程。称10 g，加入25 mL 70%的甲醇水提取，超声30 min，取2 mL加入18 mL吐温溶液，全部过免疫性亲和柱，5 mL PBS溶液和5 mL水洗涤，2 mL甲醇洗脱，氮吹干，1 mL甲醇∶水（1∶1）复溶，压滤上机。

（2）色谱条件。流动相水+甲醇+乙腈=56+22+22；流速1.0 mL/min；进样量50 μL；柱温40 ℃；激发波长360 nm；发射波长440 nm； FLD检测器。

（3）柱后衍生器条件。反应温度90 ℃；流速0.3 mL/min；流动相0.005%碘液。

1.2.5 超高效液相色谱质谱法（LC-MS/MS法）

（1）样品处理。同高效液相色谱法。

（2）色谱条件。Waters ACQUITY UPLC BEH C18液相色谱柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm），梯度洗脱。柱温为40 ℃，流动相为0.1%甲酸乙腈和0.1%甲酸水，进样量为10.0 μL，流速为0.5 mL/min，梯度洗脱条件见表1。

表1 黄曲霉毒素流动相梯度洗脱表

（3）质谱条件。电喷雾（ESI)离子源，正离子扫描方式，多反应监测模式（MRM），气帘气38 psi，温度550 ℃，离子化电压5 500 V，喷雾气为55 psi，辅助加热气为60 psi。黄曲霉毒素AFTB1、AFTB2、AFTG1、AFTG2的MRM参数条件见表2。

表2 黄曲霉毒素目标物选择反应检测优化参数表

1.2.6 酶联免疫吸附测定法（ELISA法）

黄曲霉毒素参照ELISA检测试剂盒提供的方法。

2 结果与分析

2.1 霉菌菌落特征

本次主要考虑黄曲霉的污染及茶叶本身固有霉菌（普洱茶目前研究较多的黑曲霉[11-12]）进行计数，D组样品在高温高湿条件下放置7 d后，PDA培养基上的菌落计数和形态特征如图1～4。

图1 生1样品D组培养7 d PDA培养基上菌落特征图

图2 生2样品D组培养7 d PDA培养基上菌落特征图

图3 熟1样品D组培养7 d PDA培养基上菌落特征图

图4 熟2样品D组培养7 d PDA培养基上菌落特征图

2.2 菌落计数结果

不同实验组，在存放3 d、7 d、15 d、30 d取样进行黄曲霉和黑曲霉菌落计数测定结果见表3。

表3 不同培养时间黄曲霉和黑曲霉菌落计数测定结果表

2.3 样品的霉菌生长情况

A组模拟未接种黄曲霉室温存放的产品，结果显示：无论是黄曲霉还是黑曲霉，计数结果都相当低，而且存放过程不增值。结果的差异来自于检验方法本身的随机误差。所有样品霉菌含量小于100 CFU/g，结果显示正常储存条件不具备霉菌增值条件，霉菌毒素也不容易生成。

B组模拟接种黄曲霉后室温存放样品，结果样品前期黄曲霉呈现微弱生长，7 d后开始下降的趋势。由于前期接入黄曲霉含量达到104CFU/g，黑曲霉菌落可能被黄曲霉菌落覆盖而计数不到黑曲霉，但随着存放时间延长，黄曲霉数量的下降，黑曲霉数量逐渐被计数，30 d后两种霉菌含量基本相当。证明在普洱茶中容易存在黑曲霉，整个霉菌变化过程应该是接种过程带进去的水分造成，短期内造成样品湿度增加，霉菌增殖。但由于储存环境湿度较低，样品逐渐干燥，造成后期含菌量不断下降。结果表明正常储存条件下不利于霉菌生长繁殖，霉菌毒素缺乏产生条件。

C组模拟未接种高温高湿存放样品，结果显示样品中黑霉菌含量不断增加，3 d后基本达到顶峰，直至15 d后基本恒定在108CFU/g。由A组可以看出，一般普洱茶含有极少量霉菌，当存放在高温高湿条件下时霉菌容易生长繁殖，成品普洱茶保存应当尽量避免高温高湿。

D组模拟接种黄曲霉后高温高湿存放样品，结果显示黄曲霉在培养7 d前不断增值，15 d后开始下降。而黑曲霉则不断增值，至15 d后相对恒定，黑曲霉含量在后期明显占优势。接种的黄曲霉能在茶叶中生长繁殖，初期生长较快，但随发酵时间的延长，黄曲霉在茶叶中的生长明显受到抑制，其数量逐渐下降，抑制可能来自于霉菌间的竞争或茶叶溶出性物质。结果表明在未接种黑曲霉的情况下，适合霉菌生长的C、D组样品均有黑曲霉生长，黑曲霉为普洱茶发酵中的优势菌群。

对普洱茶和对照样品试验前本底进行测定，结果见表4。ELISA法作为黄曲霉毒素的快速测定法，对黄曲霉毒素的检测不进行分型，采用ELISA法进行检测，花生粉未检出黄曲霉毒素，普洱茶均能够检出的黄曲霉毒素，采用HPLC和LC-MS/MS方法均未检出黄曲霉毒素（低于方法检出限）。

表4 样品本底，未进行培养前检测结果表

普洱茶及对照样品A、B、C、D4组样品，对存放15 d、30 d、60 d，采用3种方法进行黄曲霉毒素的检测，实验结果汇总如表5。

表5 四组样品存放不同时间检测结果表

续表5

对照组花生粉检测结果A、C组ELISA法均未检出黄曲霉毒素，HPLC和LC-MS/MS方法也未检出黄曲霉毒素。B、D组3种方法均检出黄曲霉毒素。B组可能由于花生粉本身较潮湿，室温接种条件下黄曲霉仍然可以正常生长所致。实验说明营养丰富，富含蛋白质的花生粉，极易被黄曲霉污染产生黄曲霉毒素。

普洱茶样品所有A、B、C、D4组样品，除采用ELISA法结果均能够检出的黄曲霉毒素外，采用HPLC和LC-MS/MS方法均未检出黄曲霉毒素。

3 结论与讨论

实验结果证明接种产毒黄曲霉作对照组花生粉产生黄曲霉毒素，而所有接种和未接种产毒黄曲霉的实验组普洱茶虽然黄曲霉可以生长，但采用先进的方法均未检出黄曲霉毒素。表明受黄曲霉污染的普洱茶不利于黄曲霉毒素的产生。而ELISA法用于茶叶中黄曲霉毒素检测容易被基质干扰[13]，不同时间检测结果差异显著，所检测的数据不能作为判定样品中含黄曲霉的依据。GB 5009.22-2016《食品安全国家标准 食品中黄曲霉毒素B族和G族的测定》已将ELISA列为筛查法，并且茶叶也不在可用于筛查范围。从而证明ELISA不适用于茶叶中黄曲霉毒素的检测。

目前，普洱茶黄曲霉毒素检测的报道，ELISA法几乎全部检出外，其他先进可靠的检测方法HPLC法、LC-MS/MS法除陈建玲等[5]湿仓普洱茶有11%检出超过5 μg/kg外，所有报道中均未检出黄曲霉毒素。证明正常情况下普洱茶黄曲霉毒素几乎不产生，但可能由于存储环境或发酵过程存在可能接触可以产生黄曲霉毒素的物品从而带进微量的黄曲霉毒素，或者湿仓快速发酵过程中的某些环节控制不好所致。

黑曲霉是普洱茶中的优势菌种[12]，黑曲霉的毒素报道近年来相继出现[14-15]，也有人利用黑曲霉进行普洱茶的发酵。虽然有毒菌种产毒是在特定的条件下，但应当在传统普洱茶生产发酵过程中对相关霉菌进行关注和研究，以控制生产条件，避免有毒霉菌对普洱茶品质的影响。随着人们的关注和对品质的追求，检测手段的进步，研究的深入，生产工艺的提升，销售储存条件的改进，相信普洱茶的质量能满足消费者安全健康及高品质追求的需要。

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