miR-429对CRKL表达的靶向调控作用研究

郭春梅，刘淑清，孙明忠

(1. 大连医科大学 生物技术系，辽宁 大连 116044；2. 大连医科大学 生物化学与分子生物学教研室，辽宁 大连 116044)

微小RNA(miRNA)是一类长度大约为18～24个碱基的内源非编码小RNA分子，通过与靶基因3′末端非翻译区(3′-UTR)完全或不完全互补配对形成沉默复合体(RISC)，导致mRNA降解或抑制其翻译，从而在转录后水平负性调节靶基因的表达[1-2]。miRNAs异常表达与多种疾病尤其是癌症的发生发展相关[3-4]，是肿瘤诊断、治疗及预后的研究热点。

miR-429是miR-200家族成员之一，miR-200家族包括miR-200a、miR-200b、miR-200c、miR-141、miR-429[5]。近年来研究表明，miR-429异常表达与肿瘤的发生、发展、转移、凋亡、耐药等密切相关，但miR-429在肿瘤中所起的作用一直有争议，具肿瘤特异性[6-8]。一个miRNA可影响多个靶基因，而一个靶基因又受多个miRNA的调控，miR-429有多个靶基因，可通过靶向作用于ZEB1、ZEB2、Sp1、BMI1、E2F3、KIAA0101、PAK6、Onecut2、SOX2、Bcl-2、BMK1、XIAP、c-myc、SP1、PTEN、RASSF8、TIMP2、DLC-1、p27Kip1、NOTCH1调节不同的信号通路来调控肿瘤的生物行为[6-10]。

信号接头蛋白CRKL (v-crk sarcoma virus CT10 oncogene homologue(avian)-like)是CRK家族成员之一，分子量为39 kDa，编码303个氨基酸[11-12]。CRKL包含一个SH2和两个SH3结构域，呈现SH2-SH3-SH3结构形式，在两个SH3结构域之间有一酪氨酸磷酸化位点(Y207)[13]。CRKL是酪氨酸激酶的关键底物，可通过SH2、SH3结构域招募信号通路分子，与BCAR1、GAB、ABL-1、Pax、GEF、C3G、BCR-ABL、SOS结合形成复合物参与细胞信号转导过程，进而影响细胞的分化、增殖、粘附、迁移、侵袭、凋亡等生物活动，起着信号开关的作用[13-14]。近年来研究表明，CRKL异常表达与恶性肿瘤的发生发展、迁移、侵袭、粘附、预后、耐药性密切相关，可能是潜在影响肿瘤治疗和预后的靶标分子[13-15]。本课题组前期研究亦表明CRKL与鼠肝癌Hca-P细胞[16]的体外迁移、侵袭、增殖、克隆形成能力相关，且CRKL在小鼠肝癌高、低淋巴道转移力细胞株Hca-P、Hca-F中差异表达[17]，提示CRKL与肿瘤密切相关。

本研究在肝癌HepG2细胞中探讨了miR-429对CRKL的靶向调控作用，验证了miR-429直接靶向结合于CRKL-3′-UTR第二个结合位点负性调节CRKL的表达，以及CRKL负性调控 miR-429的表达，揭示了miR-429和CRKL之间的负向调控关系，为临床抗肿瘤靶向治疗提供了坚实的理论基础和实验依据。

1 材料和方法

1.1 生物信息学预测miR-429与CRKL的结合位点

应用miRNA靶基因预测在线软件TargetScan(http://genes.mit.edu/targetscan/)、PicTar(http://pictar.bio.nqyu.edu/)和miRanda(http://microrna.sanger.ac.uk/)，根据人源CRKL的基因编码序列，预测miR-429与CRKL的结合位点。

1.2 设计野生型CRKL-3′-UTR结合位点引物

根据预测的miR-429与CRKL-3′-UTR的结合位点，利用Oligo7软件设计特异性引物扩增CRKL-3′-UTR包含miR-429潜在结合位点的片段，并根据psiCHECK-2双荧光素报告载体上的多克隆酶切位点，分别在上、下游引物添加Xho I与Not I酶切位点(下划线标记)，引物序列如下：

(1)扩增包含两个结合位点总片段的引物

Forward primer:5'-CTCGAGGCTCATAGTGAACACAGCAGACCTAGAAATGTAGC-3'

Reverse primer:5'-GCGCGGCCGCCGGCTGATGCAAGTTTTATTGAGACAATAT-3'

(2)扩增第1个结合位点的引物

Forward primer:5'-CTCGAGGCTCATAGTGAACACAGCAGACCTAGAAATGTAGC-3'

Reverse primer:5'-TAGCGGCCGCTAAAGGGCAAACACTGTTTCTAGGCAG-3'

(3)扩增第2个结合位点的的引物

Forward primer:5'-CTCGAGGGGATGATGTGGTTTTTTGCCAGGTGTTTATAAT-3'

Reverse primer:5'-GCGGCCGCCGGCTGATGCAAGTTTTATTGAGACAATAT-3'

1.3 设计突变型CRKL-3′-UTR结合位点引物

根据定点突变PCR法对CRKL-3′-UTR两个结合位点分别设计突变引物，引物序列如下(下划线表示酶切位点，波浪线表示突变碱基)。

(1)突变第1个结合位点的引物

1)突变上游片段引物

Forward primer:5'-CTCGAGGCTCATAGTGAACACAGCAGACCTAGAAATGTAGC-3'

Reverse primer:5'-TTCATGAATACAGCAGTTATCTGCCTGATGGTAATCACATTTAAAG-3'

2)突变下游片段引物

Forward primer:5'-CTTTAAATGTGATTACCATCAGGCAGATAACTGCTGTATTCATG-3'

Reverse primer:5'-TAGCGGCCGCTAAAGGGCAAACACTGTTTCTAGGCAG-3'

(2)突变第2个结合位点的引物

1)突变上游片段引物

Forward primer:5'-CTCGAGGGGATGATGTGGTTTTT-3'

Reverse primer:5'-ACACTCGATGTATTCTAAGAATATAAGTCATTATTATCACTTAATTTTATAGCAC-3'

2)突变下游片段引物

Forward primer:5'-GTGCTATAAAATTAAGTGATAATAATGACTTATATTCTTAGAATACATCGAGTG-3'

Reverse primer:5'-GCGCGGCCGCCGGCTGATGCAAG-3'

1.4 构建野生型及突变型双荧光素重组表达载体

构建野生型pMDT-19-CRKL-3'-UTR-WT、突变型pMDT-19-CRKL-3'-UTR-MUT克隆重组载体，以及野生型psiCHECK2-CRKL-3'-UTR-WT(包含miR-429与CRKL-3′-UTR两个结合位点的序列，简称WT)、psiCHECK-2-CRKL-3′-UTR-WT1(包含miR-429与CRKL-3′-UTR第1个结合位点的序列，简称WT1)、 psiCHECK-2-CRKL-3′-UTR-WT2(包含miR-429与CRKL-3′-UTR第2个结合位点的序列，简称WT2)、突变型psiCHECK-2-CRKL-3′-UTR-MUT1(包含miR-429与CRKL-3′-UTR第1个结合位点的突变序列，简称MUT1)、 psiCHECK-2-CRKL-3′-UTR-MUT2(包含miR-429与CRKL-3′-UTR第2个结合位点的突变序列，简称MUT2)双荧光素重组表达载体。

1.5 双荧光素报告实验

取对数生长期的HepG2细胞，将1×105个细胞/孔均匀铺于24孔板，置于37 ℃，5%CO2培养箱中培养24 h；将实验分WT、WT1、WT2、MUT1和MUT2组。1.5 μg psiCHECK-2-CRKL-3′-UTR-WT、psiCHECK-2-CRKL-3′-UTR-WT1、 psiCHECK-2-CRKL-3′-UTR-WT2、psiCHECK-2-CRKL-3′-UTR-MUT1、 psiCHECK-2-CRKL-3′-UTR-MUT2重质粒分别与50 mol/L miR-429 mimics或miR-429-NC瞬时转染到HepG2细胞中。转染步骤按照LipofectamineTM2000说明书操作；转染48 h后，采用promega的luciferase试剂盒进行检测，将100 μL裂解液PLB(Passive Lysis Buffer)加到24孔板中，室温温育15 min后吹打细胞；将20 μL细胞裂解液转移到黑色96孔板中，再加入50 μL LAR II(Luciferase Assay Reagent)混匀，放入酶标仪中检测萤火虫荧光素酶活性；向检测管中加入100 μL Stop试剂，检测海肾荧光素酶活性，海肾荧光素酶活性测得的数值/萤火虫荧光素酶活性测得的数值即为每组细胞的相对荧光素活性。

1.6 qRT-PCR测定

瞬时转染miR-429模拟物及其NC、miR-429抑制剂及其NC至HepG2细胞中，各组分别命名为HepG2-miR-429、HepG2-miR-NC、HepG2-LNA-miR-429、HepG2-LNA-miR-NC，瞬时转染48 h后，收集各组细胞，检测miR-429上、下调对内源性CRKL mRNA表达水平的影响。前期我们筛选到了CRKL表达稳定下调的单克隆细胞株HepG2-shCRKL及其阴性对照组单克隆细胞株HepG2-shNC、以及CRKL表达稳定上调的细胞株HepG2-PCDH-CRKL及其对照组细胞株HepG2-PCDH，细胞培养至对数生长期，收集各组细胞，检测CRKL表达上、下调对miR-429表达水平的影响。Trizol试剂提取细胞总RNA。利用Applied Biosystems StepOneTMReal-Time PCR Systems系统进行qRT-PCR反应，采用2-ΔΔCt法ACTB作为内参计算CRKL mRNA的相对表达水平，U6作为内参计算miR-429的相对表达水平。ACTB：F primer 5′-AGGCCAACCGCGAGAAG-3′, R primer 5′-ACAGCCTGGATAGCAACGTACA-3′; CRKL: F primer 5′-GTGCTTATGACAAGACTGCCT-3′, R primer 5′-CACTCGTTTTCATCTGGGTTT-3′。

1.7 Western blot (WB) 测定

瞬时转染miR-429模拟物及其NC、miR-429抑制剂及其NC至HepG2细胞中72 h后，分别收集HepG2-miR-429、HepG2-miR-NC、HepG2-LNA-miR-429、HepG2-LNA-miR-NC各组细胞，检测miR-429上、下调对内源性CRKL蛋白表达水平的影响。RIPA buffer (50 mmol/L pH 8.0 Tris-HCl, 150 mmol/L NaCl, 1% Triton X-100, 0.5% sodium deoxycholate, 0.1% SDS in the presences of 1 mmol/L Na3VO4, 1 μg/mL leupeptin and 0.5 mmol/L PMSF)提取细胞总蛋白，10%SDS-PAGE电泳后蛋白转移至NC膜，一抗、二抗孵育后，ECL发光液显影，利用凝胶成像系统软件Image Lab software 4.0.1分析CRKL/ACTB相对灰度值。

1.8 统计学方法

用SPSS 17.0统计软件进行数据分析，实验数据以均值±标准差(x±s)表示，各组间比较采用t检验分析，P≤ 0.05表示具有显著统计学意义。

2 结 果

2.1 预测miRNA的靶基因

通过在线软件预测miR-429调控的靶基因，发现TargetScan、PicTar和miRanda软件均预测出CRKL，CRKL可能是miR-429的潜在靶基因。miR-429与CRKL-3′-UTR存在两处结合位点，如图1所示。为证实CRKL是miR-429的直接靶基因，首先扩增了CRKL-3′-UTR区包含miR-429结合位点的序列，构建了野生型的双荧光素酶报告载体，为证明确实是miR-429作用预测的结合位点导致荧光素酶活性发生改变，又突变了CRKL-3′-UTR区包含miR-429结合位点的序列并构建了突变型双荧光素重组表达载体。

图1 miR-429与CRKL-3′-UTR结合位点Fig 1 Putative binding sites for miR-429 at CRKL-3′-UTR

2.2 双荧光素报告实验验证miR-429与CRKL-3′-UTR靶向结合

构建好野生型psiCHECK2-CRKL-3'-UTR-WT及突变型psiCHECK2-CRKL-3'-UTR-MUT重组表达载体后，通过双荧光素酶报告实验检测发现(图2)：与miR-NC相比，miR-429与psiCHECK-2-CRKL-3-UTR-WT共转染后使荧光素酶活性下降了(45.7±1.1)%(P=0.004)；miR-429与WT2共转染后使荧光素酶活性下降了(37.0±0.8)%(P=0.0008)，当这个结合位点被突变后，miR-429对荧光素酶活性的抑制作用基本被消除；而miR-429与WT1、MUT1共转染后对荧光素酶活性没影响。说明CRKL是miR-429的靶基因，miR-429主要靶向CRKL-3′-UTR第2个结合位点抑制CRKL的表达。

**两组间比较，P<0.01; ***两组间比较，P<0.001图2 双荧光素酶报告实验检测miR-429与CRKL-3′-UTR区结合Fig 2 Interaction between miR-429 and CRKL-3′-UTR detected with luciferase activity assay

2.3 miR-429负性调控CRKL的表达

瞬时转染miR-429模拟物及其NC、miR-429抑制剂及其NC至HepG2细胞中48 h后， HepG2-miR-429中的miR-429表达比HepG2-miR-NC上调了(6373600±10220)%(P=0.0034)(图3A)；HepG2-LNA-miR-429中的miR-429表达比HepG2-LNA-miR-NC下调了(76.2±3.7)%(P=0.0103)(图3B)。而HepG2-miR-429中的内源性CRKL 蛋白表达比HepG2-miR-NC下调了(55.0±1.5)%(P=0.0089)(图3C)，HepG2-LNA-miR-429中的内源性CRKL 蛋白表达比HepG2-LNA-miR-NC上调了(44.3±1.0)%(P=0.0038)(图3D)。但HepG2-miR-429及HepG2-LNA-miR-429与各自nc组比较其内源性CRKL mRNA 表达变化不大(图3C、D)。

*两组间比较，P<0.05; **两组间比较，P<0.01A：瞬时转染miR-429模拟物上调miR-429的表达；B：瞬时转染miR-429抑制剂下调miR-429的表达；C：miR-429上调抑制内源性CRKL蛋白表达；D：miR-429下调促进内源性CRKL蛋白表达图3 miR-429对内源性CRKL表达的影响Fig 3 Effect of miR-429 on endogenous CRKL expression

2.4 CRKL负性调控miR-429的表达

G418有限稀释法筛选得到了CRKL表达稳定下调的单克隆细胞株HepG2-shCRKL及其阴性对照组单克隆细胞株HepG2-shNC，与HepG2-shNC相比，HepG2-shCRKL细胞中CRKL 蛋白表达水平降低了(97.0±0.6)%(P<0.0001)(图4A)。通过慢病毒转染筛选得到了CRKL表达稳定上调的细胞株HepG2-PCDH-CRKL及其对照组细胞株HepG2-PCDH，与HepG2-PCDH相比，HepG2-PCDH-CRKL细胞中CRKL 蛋白表达水平升高了(127.3±12.0)%(P=0.0005)(图4B)。上调或下调CRKL后检测了miR-429的表达变化，与HepG2-shNC相比，CRKL下调细胞株HepG2-shCRKL中miR-429表达水平升高了(102.8±20.0)%(P=0.0069)(图4C)；与HepG2-PCDH相比，CRKL上调细胞株HepG2-PCDH-CRKL 中miR-429表达水平降低了(92.4±3.2)%(P=0.0009)(图4D)。

3 讨 论

miR-429是miR-200家族重要成员，位于人类1号染色体上，在多种肿瘤中异常表达，与肿瘤的发生、发展、迁移、侵袭等密切相关[5-10]，但miR-429在不同类型肿瘤中发挥的作用不同，其具体作用分子机制不清。有研究报道，CRKL是miR-429的靶基因[18-19]，是CRK家族重要成员，广泛存在于真核生物体内，可与多种信号分子结合形成复合物，将信号从上游传递给下游，起着承上启下的作用，是信号转导中重要的多功能接头蛋白[11]。但目前只报道过miR-429抑制CRKL蛋白水平的表达，miR-429与CRKL的结合位点、miR-429是否影响CRKL mRNA 水平的表达以及CRKL是否调控miR-429的表达尚无人报道。

miRNA靶基因预测软件发现miR-429与CRKL-3′-UTR存在两处结合位点，miR-429是与CRKL-3′-UTR这两处结合位点同时结合调控CRKL的表达，还是只与一处结合位点结合。为解决这个问题，我们根据预测的结合位点序列，设计了突变引物，构建了野生型及其突变型双荧光素重组表达载体。我们通过双荧光素报告实验检测，首次发现miR-429只与CRKL-3′-UTR第2处结合位点靶向结合，为研究miR-429在肝癌中的调控机制找到了作用靶点。

**两组间比较，P<0.01; ***两组间比较，P<0.001; ****两组间比较，P<0.0001A：下调CRKL的表达；B：上调CRKL的表达；C：CRKL下调抑制内源性miR-429表达；D：CRKL上调促进内源性miR-429表达图4 CRKL对内源性miR-429表达的影响Fig 4 Effect of CRKL on endogenous miR-429 expression

miR-429与CRKL-3′-UTR靶向结合后，是否调控CRKL的表达，为进一步确认CRKL是miR-429的直接调控靶基因，我们瞬时转染miR-429模拟物及其抑制剂，检测miR-429过表达或低表达后对CRKL表达的影响。qRT-PCR结果表明通过瞬时转染，我们成功地上调或下调了miR-429的表达。WB结果表明miR-429上调可以抑制内源性CRKL的蛋白表达，miR-429下调可以促进内源性CRKL的蛋白表达。miR-429对CRKL mRNA表达水平的影响无人研究，我们的结果表明：miR-429上调和下调对CRKL的mRNA表达无影响。结果说明miR-429 靶向结合于CRKL-3′-UTR在转录后翻译水平负性调节CRKL的表达，而对其转录水平无影响。

以上结果说明miR-429可通过靶向作用于CRKL-3′-UTR在转录后蛋白翻译水平负性调控CRKL的表达，CRKL是否调控miR-429的表达？我们成功获得了CRKL表达稳定下调或上调的细胞株，首次发现CRKL下调可促进内源性miR-429的表达，相反CRKL上调可抑制内源性miR-429的表达，说明CRKL同时可以负向调控miR-429的表达，miR-429和CRKL可以互相调控，但CRKL调控miR-429的机制不清还需进一步探讨。

本实验结果表明，CRKL是miR-429的直接靶基因，miR-429主要直接靶向CRKL的3′端非编码区第2个结合位点在转录后翻译水抑制CRKL的表达，同时CRKL又可以调控miR-429的表达，本研究为肿瘤的小分子治疗靶点提供了有利的实验依据。

[1] Fang Y, Gao W. Roles of microRNAs during prostatic tumorigenesis and tumor progression[J]. Oncogene, 2014, 33(2): 135-147.

[2] Calin GA, Croce CM. MicroRNA signatures in human cancers [J] . Nat Rev Cancer, 2006, 6(11):857-866.

[3] Zimmerman AL, Wu S. MicroRNAs, cancer and cancer stem cells[J]. Cancer Lett, 2011, 300(1):10-19.

[4] Callegari E, Gramantieri L, Domenicali M, et al. MicroRNAs in liver cancer: a model for investigating pathogenesis and novel therapeutic approaches [J]. Cell Death Differ, 2015, 22(1):46-57.

[5] Hu X, Macdonald DM, Huettner PC, et al. A miR-200 microRNA cluster as prognostic marker in advanced ovarian cancer[J]. Gynecol Oncol, 2009, 114(3):457-464.

[6] Chen J, Wang L, Matyunina LV, et al. Overexpression of miR-429 induces mesenchymal-to-epithelial transition (MET) in metastatic ovarian cancer cells[J]. Gynecol Oncol, 2011, 121(1):200-205.

[7] Sun TW, Wang CM, Xing J, et al. miR-429 modulates the expression of c-myc in human gastric carcinoma cells[J]. Eur J Cancer, 2011, 47(17):2552-2559.

[8] Snowdon J, Zhang X, Childs T, et al. The microRNA-200 family is upregulated in endometrial carcinoma[J]. PLoS One, 2011, 6(8):e22828.

[9] Li J, Du L, Yang Y, et al. MiR-429 is an independent prognostic factor in colorectal cancer and exerts its anti-apoptotic function by targeting SOX2[J]. Cancer Lett, 2013, 329(1):84-90.

[10] Wu CL, Ho JY, Chou SC, et al. MiR-429 reverses epithelial-mesenchymal transition by restoring E-cadherin expression in bladder cancer[J]. Oncotarget, 2016, 7(18):26593-26603.

[11] Guo CM, Liu SQ, Sun MZ. The role of CT10 regulation of kinase-like in cancer[J]. Future Oncol, 2014, 10(16):2687-2697.

[12] Birge RB, Kalodimos C, Inagaki F, et al. Crk and CRKL adaptor proteins: networks for physiological and pathological signaling[J]. Cell Commun Signal, 2009, 7:13.

[13] Sriram G, Birge RB. Emerging roles for crk inhuman cancer[J]. Genes Cancer, 2011, 1(11):1132-1139.

[14] Bell ES, Park M. Models of Crk Adaptor Proteins in Cancer[J]. Genes Cancer, 2012, 3(5-6):341-352.

[15] Birge RB, Kalodimos C, Inagaki F, et al. Crk and CRKL adaptor proteins: networks for physiological and pathological signaling[J]. Cell Commun Signal, 2009, 7(1):1-23.

[16] Lin QY, Sun MZ, Guo CM, et al. CRKL overexpression suppresses in vitro proliferation, invasion and migration of murine hepatocarcinoma Hca-P cells[J]. Biomed Pharmacother, 2015, 69:11-17.

[17] Shi J, Meng LL, Sun MZ, et al. CRKL knockdown promotes in vitro proliferation, migration and invasion, in vivo tumor malignancy and lymph node metastasis of murine hepatocarcinoma Hca-P cells[J]. Biomed Pharmacother, 2015, 71:84-90.

[18] Wang Y, Dong X, Hu B, et al. The effects of Micro-429 on inhibition of cervical cancer cells through targeting ZEB1 and CRKL[J]. Biomed Pharmacother, 2016, 80:311-321.

[19] Wang F, Jiang C, Sun Q, et al. Downregulation of miR429 and inhibition of cell migration and invasion in nasopharyngeal carcinoma [J]. Mol Med Rep, 2016, 13(4):3236-3242.