星点设计-响应面法优化肉桂油β-环糊精包合物制备工艺

★ 谭舒舒 皮达 陈欢 孙娟芳 胡源祥 杨武亮

(江西中医药大学现代中药制剂教育部重点实验室 南昌 330004)

肉桂油为樟科植物肉桂CinnamomumcassiaPresl 的干燥枝、叶经水蒸气蒸馏提取的挥发油[1]，其挥发油的主要成分为桂皮醛，相对含量在17.1%～73.9%，具有抗炎、抗菌、镇静、解热镇痛、抗焦虑、解表、发汗、抗肿瘤、降糖、神经保护等多种药理作用。对神经系统、心血管、肿瘤、糖尿病等疾病均有一定的防治作用[2-5]。但由于肉桂油对光与热的不稳定性，使其在应用受到限制。目前，使用β-环糊精包合挥发油以提高其稳定性的应用较为普遍，β-环糊精包合物是包埋的水分子被相应的客分子取代所形成的物质，可增加药物溶解度，掩盖挥发油的异味，提高其生物利用度和患者顺应性[6]。对于肉桂油β-环糊精包合物的制备多采用正交设计或均匀设计进行研究，所得的包合物中桂皮醛的含量为2.99%～7.33%[7-9]。而星点设计-响应面法(Central composite design-response surface methodology，CCD-RSM)是利用合理的实验设计，在二水平析因设计的基础上加上星点和中心点构成的，可采用多元二次回归方程拟合因素与响应值之间的函数关系，通过对回归方程的分析寻求最优工艺参数，解决多变量问题的一种统计方法，适用于多因素实验设计，具有使用简便、精度高、预测性好的优点[10]。故本实验采用星点设计-响应面法优化肉桂油β-环糊精包合物制备工艺，并进行预测分析，以高效液相色谱法(HPLC)和热重差热分析法(TG-DTA)对该包合物进行质量评价，以期能够最大程度的提高挥发油的利用率，为肉桂油的临床应用提供科学依据。

1 试验材料

1.1 仪器 Agilent 1260(四元泵、VWD检测器、自动进样器)；日本精工热重差热综合热分析仪 EXSTAR6000 TG/DTA6300。

1.2 试药 桂皮醛对照品(C11667480，含量测定用，德国 Dr.Ehrenstorfer)；β-CD (安徽山河药用辅料股份有限公司)；肉桂油(自制，其中桂皮醛含量85.8%)；甲醇(HPLC级，西陇科学股份有限公司)；无水乙醇(西陇科学股份有限公司)；冰醋酸(国药集团)；水为双重蒸馏水，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 肉桂油β-CD包合物的制备 取β-CD适量，精密称定，加蒸馏水8倍水量，水浴加热使其溶解，放冷至规定温度，恒温水浴研磨，量取挥发油适量，精密称定，按 1∶1比例无水乙醇稀释，将挥发油稀释液缓慢注入β-CD溶液中(边加边研磨)，加入速度1mL/min，加完后继续研磨，低温冷藏24 h， 抽滤至干，适量无水乙醇洗涤3次，60 ℃真空干燥24 h，得白色粉末状干燥包合物。

2.2 肉桂油β-CD包合物中桂皮醛的含量测定

2.2.1 对照品溶液的制备 吸取桂皮醛对照品约10μL，精密称定为0.01168g，置10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，从中精密吸取1mL，置另一个25mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，即得含46.72 μg/mL的桂皮醛对照品溶液。

2.2.2 肉桂油 β-CD包合物供试液溶液的制备 取肉桂油β-CD包合物约 0.5 g，精密称定，置于具塞锥形瓶，精密加入甲醇50mL，称定质量，超声处理 30min，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，精密量取续滤液1mL，置25mL棕色瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。

2.2.3 色谱条件 色谱柱为Diamonsil C18(250mm×4.6 mm,5μm)。流动相为甲醇：醋酸水(45∶55)；检测波长为290 nm；流速为1.0 mL/mL；柱温30℃；进样量5μL。理论塔板数按桂皮醛峰计算，应不得低于3000。色谱图见图1。

A.桂皮醛对照品；B.肉桂油包合物

2.2.4 线性范围考察 精密吸取桂皮醛对照品溶液1，2，3，5，8，10，12μL注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定，以对照品的量(ng)为横坐标(X)，色谱峰峰面积为纵坐标(Y)，绘制标准曲线，得回归方程：Y=7.9114X+1.5039，R=0.9999。结果表明，桂皮醛进样量在46.72～560.64ng范围内呈良好线性关系。

2.2.5 精密度试验 精密吸取同一对照品溶液5 μL，在上述相同色谱条件下重复进样6次，测定桂皮醛峰面积的RSD为0.97%。结果表明，6次测得的相对标准偏差低于2.0%，具有较好的精密度。

2.2.6 重现性试验 称取最优条件下制备的同一包合物样品共6份，每份约0.5 g，精密称定，按供试品溶液的制备方法制备供试液，测定桂皮醛的含量，计算桂皮醛含量的RSD为0.61 % 表明该方法重现性良好。

2.2.7 稳定性试验 取最优条件下制备的同一包合物样品约0.5 g，精密称定，按供试品溶液的制备方法制备供试液，分别在样品制备后的0，2，4，8，10，12，24 h进样，按照上述色谱条件测定桂皮醛峰面积，测得桂皮醛峰面积的RSD为0.38 %。结果表明，供试品溶液在室温下24 h内稳定。

2.2.8 加样回收率试验 称取最优条件下制备的同一包合物样品(已知桂皮醛含量为 10.14 %)共6份，每份约0.5 g，精密称定，分别加入一定量的桂皮醛对照品(1.168mg/mL)溶液1 mL ，按供试品溶液的制备方法制备供试液测定，用下列公式计算加样回收率。结果表明桂皮醛的平均回收率为100.32 %，RSD为1.84%，符合方法学要求，结果见表1。

表1 桂皮醛加样回收率试验结果(n=6)

2.2.9 肉桂油包合物的含量测定 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，即得。

2.3 星点设计-响应面法优化肉桂油β-环糊精包合物制备工艺

2.3.1 包合物制备工艺最优参数的确定 以肉桂油β-CD包合物中桂皮醛含量为评价指标，在单因素试验的基础上，确定β-CD与肉桂油的包合比例(A)，包合温度(B)及包合时间(C)作为响应面实验的自变量，根据星点设计的原理，每个因素设5个水平，用代码值﹣α，-1，0，1，﹢α标识，代码值所代表的实际物理量如表2所示。

表2 实验因素水平表

2.3.2 星点设计-响应面法优化包合工艺 采用Design-Expert 8.0.6软件中的星点设计-响应面法，以桂皮醛含量为评价指标，根据实验因素水平表，按2.1 肉桂油β-CD包合物的制备项下制备肉桂油β-CD包合物。试验安排及结果见表3。

2.3.4 响应面法分析方案与结果 应用Design-Expert 8.0.6软件对表3中实验结果进行多元回归拟合，得到拟合二次多项回归模拟方程为：

Y=10.88-0.35A-0.59B-0.096C+0.77AB-0.82A2-0.58B2-0.53C2

表3 肉桂油β-CD包合工艺星点试验分析

对上述拟合方程进行系数显著性检验和方差分析，结果如表4所示。由表4可知方程的A、C2对实验结果影响显著，B、AB、A2、B2对实验结果影响极显著，但线性项和交互项影响不显著，说明各因素对响应值的影响不是简单的线性关系。回归模型的Pr>F值为0.0007，差异高度显著，失拟项Pr>F值为0.3763，大于0.05，影响不显著，说明模型中无失拟因素存在，所得方程与实际拟合中非正常误差所占比例小，说明回归方程在整个回归方程区域内你和情况良好。方程决定系数R2为0.8347，说明响应值的变化有83.47%来源于所选变量。模型中各自变量的三维响应曲面见图2，其响应曲面图直观地反映了各因素交互作用对桂皮醛含量的影响，由图可知肉桂油与β-CD的包合比例、包合温度及包合时间对包合工艺的影响都比较显著，两两因素间存在明显交互作用。

利用该响应面方程进行规划，即优化配置。选择求桂皮醛最大值点并运算，得研磨法制备肉桂油β-CD包合物的最佳工艺为：β-CD与肉桂油的比例为9.9976∶1、包合温度为49.7 ℃、包合时间为58.3935 min。将各因素进行微调以适应实际生产，最终确定包合物制备的最佳包合工艺为β-CD与肉桂油的比例为10∶1、包合温度为50 ℃、包合时间为58 min。

2.3.5 最佳包合工艺验证 按星点设计-响应面法所确定的最佳包合工艺参数，制备肉桂油β-CD包合物样品3份，测定包合物中桂皮醛含量。结果分别测得桂皮醛含量为：10.14%，10.05%，10.15%。平均含量为10.11%。预测值为10.21%，偏差率分别为0.68%，1.56%和0.98%。该拟合模型较好地反映工艺中各因素与评价指标之间的关系，且稳定可靠。

表4 回归模型方差分析表

图2 包合比例、包合温度和包合时间对肉桂油

2.4 包合物的热重-差热分析鉴别 取适量的空白β-CD粉末(A)，适量的β-CD粉末与肉桂油的物理混合物(B)和肉桂油β-CD包合物(C)为样品，置于瓷坩埚中，三者样品称样量分别为2.657，3.064，3.306 mg。扫描条件为：以空坩埚为参比；氮气；升温速率：10.00 ℃/min；升温范围：0 ～ 500 ℃。扫描可得三者的TG-DTA曲线，结果见图3。

从样品β-CD(A)的TG-DTA图谱可以看出，β-CD失重分为两个阶段：第一阶段温度范围是70℃～100 ℃(TG曲线)，对应的吸热峰为90 ℃(DTA曲线)，该峰是β-CD的失水峰；第二阶段温度范围是290℃～350 ℃，对应的吸热峰为320 ℃，为β-CD自身氧化分解峰。

从样品β-CD与肉桂油的物理混合物(B)的TG-DTA图谱可以看出，样品A，B的TG-DTA图谱十分相似 ，而且吸热峰的位置和峰形大小也十分接近。但其失重分为三个阶段：第一阶段与第三阶段失重的温度范围和对应的吸热峰基本一致，但第二阶段温度范围是100℃～150℃，对应的吸热峰为130℃，为桂皮醛的气化峰。

A：β-CD；B：肉桂油与β-CD物理混合物；C：肉桂油β-CD包合物

而样品肉桂油β-CD包合物(C)的TG-DTA图谱可以看出，与A，B相比，β-CD的失水峰已经消失，是由于在包合过程中β-CD已经失去了内腔的结晶水，进而被桂皮醛占据了。其失重的温度范围是290～350 ℃，对应的吸热峰为320 ℃，为β-CD自身氧化分解峰。此外，由于β-CD与桂皮醛的相互作用力，使得体系热稳定性增加使得吸热峰与A，B相比都要滞后一些。表明肉桂油β-CD包合物已经形成。

3 讨论

本实验得到肉桂油β-环糊精包合物最佳制备工艺条件为：β-CD与肉桂油的包合比例(g/g)10∶1，包合温度50 ℃，包合时间58 min，在此条件下所得包合物中桂皮醛平均含量为10.10%，且经热重-差热分析鉴别表明该包合物已经形成。故采用星点设计-响应面法优化肉桂油β-环糊精包合物的最佳制备工艺稳定、可靠，且肉桂油被 β-CD 包合后，对光和热的稳定性显著提高，为其广泛临床应用提供科学依据。

桂皮醛为肉桂油的主要成分，具有抗炎、解热镇痛、镇静、抗肿瘤、神经保护等药理作用，故本实验以包合物中桂皮醛含量为评价指标。本实验曾比较过研磨法、饱和水溶液法、超声法及胶体磨法对肉桂油β-环糊精包合物影响，发现研磨法所得的包合物中桂皮醛的含量较高，故采用研磨法制备该包合物。本实验包合物制备过程中，在研磨静置之后采用适量双蒸水及无水乙醇洗涤，将未进行包合的β-CD和肉桂油冲洗掉，发现实际所得包合物为投料量的80%～90%，且当β-CD与肉桂油的包合比例为10∶1时，所得包合物中桂皮醛平均含量为10.10%，故可能实际研磨过程中β-CD与肉桂油的包合比例小于投入量的比例，实际包合比例可能为8.5∶1，导致桂皮醛平均含量大于10%。目前肉桂油包合物的制备多以挥发油的包合率为评价指标进行正交试验、均匀设计或单因素筛选包合工艺[7-9]，本实验采用星点设计-响应面法并结合 Design-Expert 8.0.6软件拟合数学模型，具有良好的预测性，从多个角度考察、评价，从而得到一个理论的最佳条件，再从实际的实验操作出发，验证出理论最优条件的可行性。

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