紫苏叶花青素提取工艺及其活性研究

黄红雨，赵虎，金晓艳，*

（1.昌吉职业技术学院，新疆昌吉831100；2.昌吉州中医医院，新疆昌吉831100）

紫苏 （Perilla frutescens（L.）Britton） 是唇形科（Labiatae）一年生药食同源植物[1]。紫苏叶含有蛋白质、挥发油、多酚、黄酮、色素等多种营养成分，具有抗菌消炎、防过敏、解热及抗氧化、调节血脂、抗肿瘤、改善肝机能等健康促进功能[2-5]。花青素是一种黄酮类的水溶性色素，一般来源于梗、叶片和果实。目前经常借助水提法[6]和酸化乙醇法提取[7]，其中因水提法费时、提取量少、效率低、杂质较多等缺点应用较少，酸化乙醇法应用较广泛，可防止非酰基化花青素降解。超声波辅助提取法，是借助超声波来提高得率的一种新技术，有快速高效、低成本等优点，具有良好的发展前景广阔。张鑫[8]等对紫苏叶花青素提取得出其最优条件为料液比1∶30，50%乙醇体积，50℃处理120 min，此时提取率为5.6%。熊何健[9]等采用DPPH法测定桑葚花青素抗氧化能力，李敏[10]等采用1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除能力测定、铁还原抗氧化能力测定（ferric-reducing antioxidant potential assay，FRAP）、氧自由基吸收容量测定 （oxygen radical absorbance capacity assay，ORAC）与细胞抗氧化性（cellular antioxidant activity，CAA）等方法对比了黑莓、黑米麸、蓝莓、紫心苷中提取的花青素的抗氧化活性；此外，有报道对紫苏叶挥发油以及紫苏全草的抑菌活性进行研究[11-13]，但对紫苏叶花青素的抑菌性研究较少。

近些年，花青素因其天然、安全性好、优良效果、资源可更新等优势在保健品、香料、医药及化妆品等领域都有良好的发展前景[14]。本文以紫苏叶为对象，探究其花青素的提取及抗氧化和相关抑菌特性，旨在为开发紫苏叶花青素这一天然色素资源提供理论支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

紫苏：采摘于浙江滨江区，洗净后烘干，粉碎后用60目筛过滤备用。DPPH：日本东京化成工业株式会社；2，4，6-三（2'-吡啶基）-1，3，5-三嗪（2，4，6-tri（2-pyridyl）-1，3，5-triazine，TPTZ）：Sigma-Aldrich 公司；无水乙醇、双氧水（30%）、硫酸亚铁、VC、邻苯三酚（焦性没食子酸）、水杨酸、醋酸钠（均为分析纯）：南京化学试剂股份有限公司。

1.2 仪器与设备

FZ-200i系列精密电子天平：上海统舒电子科技有限公司；DHG-9075A电热恒温鼓风干燥箱：上海林频仪器股份有限公司；RE-52D旋转蒸发水浴槽：上海青浦沪西仪器厂；722N分光光度计：上海精密科学仪器有限公司；SPH-103B超凡型小容量恒温培养振荡器：上海世平实验设备有限公司；HPX-9052MBE电热恒温培养箱：上海博迅医疗生物仪器股份有限公司；90 mm培养皿：南通市卫宁实验器材有限公司。

1.3 试验菌种

金黄色葡萄球菌（ATCC29213）、大肠杆菌（ATCC44102）、荧光假单胞菌（Ip01）、腐败希瓦氏菌（AEG10146.1）：昌吉职业技术学院药学与医学技术分院实验室保藏。

2 方法

2.1 紫苏叶花青素的提取

2.1.1 乙醇提取法

2.1.1.1 单因素设计

提取温度：称取紫苏叶粉末5.0 g，加入60%乙醇溶液，2.0%HCl，料液比为 1 ∶20（g/mL），提取 2.0 h。考察提取温度分别为 40、50、60、70、80 ℃时花青素的得率。

提取时间：称取紫苏叶粉末5.0 g，加入60%乙醇溶液，2.0%HCl，料液比为 1 ∶20（g/mL），60 ℃的条件下提取，考察提取时间分别 1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h 时花青素的得率。

HCl体积分数：称取紫苏叶粉末5.0 g，加入60%的乙醇溶液，料液比为1∶20（g/mL），60℃的条件下提取2.0 h，考察HCl体积分数分别为1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%时花青素的得率。

乙醇体积分数：称取紫苏叶粉末5.0 g，分别加入40%、50%、60%、70%、80%的乙醇溶液，2.0%HCl，料液比为 1∶20（g/mL），60℃的条件下提取 2.0 h，考察花青素的得率。

2.1.1.2 正交试验

正交试验因素水平见表1。

表1 乙醇提取法正交试验因素水平表Table1 The table of factor-level of orthogonal test using ethanol extraction

在单因素基础上，考察提取温度、提取时间、HCl体积分数、乙醇体积分数等因素对紫苏叶花青素得率的影响，利用L9（34）正交试验确定最佳工艺条件。

2.1.2 超声波辅助提取法

2.1.2.1 单因素设计

在乙醇提取工艺的基础上，选择乙醇体积分数为60%，进行试验。

超声功率：称取紫苏叶粉末5.0 g，在料液比1∶30（g/mL），40℃提取20 min，考查超声功率分别为350、400、450、500、550 W 时花青素的得率。

超声时间：称取紫苏叶粉末5.0 g，在超声功率450 W，料液比1∶30（g/mL），40℃下提取，考查超声时间分别为 10、15、20、25、30 min 时花青素的得率。

料液比：称取紫苏叶粉末5.0 g，在超声功率450 W，40℃提取20 min，考查料液比分别为1∶10、1∶20、1 ∶30、1 ∶40、1 ∶50（g/mL）时花青素的得率。

超声温度：称取紫苏叶粉末5.0 g，在超声功率450 W，料液比 1 ∶30（g/mL），提取 20 min，考查提取温度分别为 20、30、40、50、60 ℃时花青素的得率。

2.1.2.2 正交试验

选择料液比、超声时间、超声温度、超声提取功率4个因素，进行L9（34）正交试验确定最佳工艺，见表2。

表2 超声波辅助提取正交试验因素水平表Table2 The table of factor-level of orthogonal test using ultrasound-assisted extraction

2.2 测定花青素得率

pH 1.0缓冲液：配制0.02 mol/L的KCl溶液及0.2 mol/L盐酸溶液，以25∶76的体积比混合，再用KCl溶液调 pH（1.0±0.1）。pH 4.5 缓冲液：称取 1.64 g NaAc溶解于 100 mL 蒸馏水中，调 pH（4.5±0.1）。

取1.0 mL紫苏叶花青素溶液，分别用pH 1.0和pH 4.5的缓冲液稀释，反应平衡120min后，测定其吸光值。

式 中 ：A=（A520nm-A700nm）（pH1.0）-（A520nm-A700nm）（pH4.5）；V为最终体积，mL；MW 为分子量，其值为449；DF为稀释倍数；ε为摩尔吸光系数，其值为29 600；m 为样品的质量，g。

2.3 抗氧化性测定

2.3.1 总抗氧化能力测定

FRAP法[15]：取4.9 mL FRAP试剂与0.1 mL样品溶液，反应10 min后测593 nm处吸光值，每组试验重复3次。

FRAP试剂：0.3mL醋酸缓冲液（pH 3.6）：10 mmol/L TPTZ（溶于40 mmol/L盐酸）：20 mmol/L FeCl3=10∶1∶1（体积比），避光储存。

2.3.2 DPPH·清除率的测定[16]

用无水乙醇配制0.1 mmol/L的DPPH溶液，储存于棕色瓶中。将3.8 mL DPPH溶液和0.2 mL样品溶液混匀反应30 min，测定517 nm处吸光度A1；将3.8 mL DPPH溶液和0.2 mL样品溶液、稀释液（60%乙醇）混合摇匀，测定吸光值A0。试验重复测3次。

2.3.3 羟自由基（·OH）清除率的测定

参照Meng L等[17]方法，取2 mL磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline，PBS，pH=7.4），依次加入20 mmol/L乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）和 12 mmol/L FeSO4混合溶液 0.1 mL，一定浓度的紫苏花青素溶液1 mL、100 mmol/L H2O20.1 mL，用磷酸盐缓冲液定容至5 mL，迅速混匀，置于37℃水浴培养15 min，水浴完成后，取出冷却至室温，并在510 nm波长下测定各管溶液的吸光度。A0为未加花青素溶液的体系其吸光数值，A样品为加入一定浓度紫苏花青素溶液测定其吸光度值，记录数据，按下式计算清除率（%）。

2.3.4 超氧阴离子（O2-·）清除率的测定

参照Meng L等[17]方法，在各管中加入4 mL Tris-HCl（pH 8.2），2 mL 邻苯三酚溶液（10 mmol/L），样品溶液2 mL，2 mL超纯水为对照。将各试管置于37℃水浴中反应10 min。水浴完成后，各试管加1 mL盐酸（6 mol/L，约22%）溶液终止反应，冷却至室温，并在325 nm波长下测吸光度。A0为未加花青素溶液的体系其吸光数值，A样品为加入一定浓度紫苏花青素溶液测定其吸光度值，记录数据，计算公式如下：

2.4 抑菌性测定

2.4.1 菌种活化及菌悬液制备

将保存的菌种反复活化2次，细菌置于30℃孵育24 h。取活化好的供试菌采用梯度稀释法用90 mL生理盐水制成菌悬液，使菌液浓度到1×106cfu/mL～1×107cfu/mL，于4℃冰箱保存，备用。

2.4.2 抑菌活性测定

采用牛津杯法测定：取上述制备好的各待测菌液0.1 mL置于LB琼脂平板表面，涂布均匀后置于30℃培养箱中10 min，表面干燥后等距离平放做好标记的牛津杯，每支杯内分别加入150 μL不同浓度样品，对照采用无菌水，30℃孵育24 h～48 h，记录抑菌活性，重复3次。

2.4.3 最小抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）测定和最低杀菌浓度（minimum bactericidal concentration，MBC）

用对倍稀释法将紫苏叶提取液稀释至0.312 5 mg/mL～10 mg/mL 6个梯度，分别吸取各个浓度梯度的紫苏叶提取液1 mL与约15 mL培养基充分混匀，制备含样液的平板，吸0.1 mL菌悬液均匀涂布后于30℃恒温培养24 h，以完全无菌生长的平板相对应的浓度记为MIC。

将MIC试验中的无菌生长的平板放回30℃培养箱，继续孵育24小时后记录，以完全无菌生长的平板所对应的浓度记为MBC。

3 结果与分析

3.1 乙醇提取法

3.1.1 单因素试验

提取温度、提取时间、HCl体积分数、乙醇体积分数对紫苏叶花青素得率的影响见图1。

从图1A中知，花青素得率随着温度的增加而增多，60℃时花青素得率最大，为3.932 mg/100 g。温度大于60℃时，所得花青素得率反而降低。可能是因为温度升高，分子渗透和运动速度变快，利于花青素物质的溶出，然而温度过高会使溶剂中的乙醇浓度降低，也会使花青素结构不稳定而被分解，导致得率降低，因此选择60℃为最佳。

图1 提取温度、提取时间、HCl体积分数、乙醇体积分数对紫苏叶花青素得率的影响Fig.1 The effect of extraction temperature，extraction time，HCl volume fraction，ethanol volume fraction on the yield of anthocyanin from Perilla frutescens leaves

从图1B中看出，花青素得率在2.0 h时达到最大，为3.967 mg/100 g。低于2.0 h，花青素溶出的量较少；超过2.0 h，长时间处理使得的花青素稳定性下降，所以最佳提取时间为2.0 h。

从图1C中看出，随着盐酸体积分数的升高，所得花青素得率增大，盐酸体积分数在2.0%达到最大，为3.944mg/100g；大于2.0%时，所得花青素得率有所下降，说明盐酸体积分数为2%时，此时，花青素结构稳定。

从图1D可知，花青素得率随着乙醇体积分数的增加而呈先增加后减少趋势。最终选择乙醇体积分数为60%是因为60%的乙醇体积分数与花青素粗提物的极性相近，此时花青素溶解程度最好，更便于花青素类化合物的溶出。乙醇浓度过低时，不利于花青素的溶出；过高时会增加紫苏叶中其他类物质的溶出，干扰因素增加。

3.1.2 正交试验

在单因素的基础上进行正交试验，乙醇提取法试验结果见表3。

表3 乙醇提取法正交试验结果表Table3 Thetableoforthogonaltestresultsusingethanolextraction

从表3中看出，对紫苏叶花青素提取影响因素由大到小依次为提取温度、乙醇体积分数、HCl体积分数、提取时间。由极差分析知，最佳因素水平组合为A2B3C3D2，即提取温度为60℃，提取2.5 h，乙醇和盐酸体积分数60%和2.5%，在此条件下，进行验证试验，重复3次，所得紫苏叶花青素得率为4.003 mg/100 g，略多于正交试验最优组合（处理6）A2B3C1D2的3.978 mg/100 g，所以选择A2B3C3D2为最佳提取工艺。

3.2 超声波辅助提取法

3.2.1 单因素试验

超声功率、超声时间、料液比、超声温度对紫苏叶花青素得率的影响见图2。

图2 超声功率、超声时间、料液比、超声温度对紫苏叶花青素得率的影响Fig.2 The effect of ultrasonic power，ultrasonic time，solid-liquid ratio，ultrasonic temperature on the yield of anthocyanin from Perilla frutescens leaves

由图2A知，超声功率为450 W时，花青素得率最高。过高的超声功率对花青素有破坏作用，高提取功率下，样品温度会升高太快，花青素结构遭到破坏，得率下降，低提取功率下，反应温度不会升高过快，得率随功率（小于450 W）的增加有增大的趋势。

由图2 B知，当超声时间为20 min时，花青素得率最高。随着超声波加热时间的延长得率呈现先增加后降低的趋势。超声波在短时间内即可造成细胞破碎，增加花青素的溶出，得率升高；降低的原因可能是花青素在长时间加热过程中，热稳定性发生了改变，同时也会增加其他高分子杂质的进出，从而得率降低。

由图2 C知，加大料液比，花青素得率会不断增大，在料液比为1∶30（g/mL）时，花青素得率达到最大，随后，得率基本维持不变。是因为料液比较低时，花青素的浸出率低，而料液比较高时，浸提液中花青素浓度高，得率也相应增高。

由图2D知，随着温度的升高，所得花青素得率逐渐增多，40℃达到最大，为5.282 mg/100 g。温度超过40℃时，所得花青素含量反而降低。可能是因为高温下，渗透和热降解速度变快，花青素结构不稳定而被分解，导致得率降低。

3.2.2 正交试验

超声波辅助提取法正交试验结果见表4。

表4 超声波辅助提取法正交试验结果表Table4 The table of orthogonal test results using ultrasoundassisted extraction

由表4表明，各因素对测定结果的影响次序为：超声功率＞超声温度＞料液比＞超声时间。由极差分析得出最佳提取工艺为A'2B'2C'3D'2：超声功率450 W，超声时间 20 min，料液比 1∶40（g/mL），超声温度 40 ℃。在此条件下，进行验证试验，重复3次，所得紫苏叶花青素得率为5.489 mg/100 g，略多于正交试验最优组合（处理 6）A'2B'3C'1D'2的 5.424 mg/100 g，所以选择A'2B'2C'3D'2为最佳提取工艺。

3.2.3 乙醇提取与超声波辅助提取花青素对比分析

不同提取方法比较见表5。

表5 不同提取方法比较Table5 Comparison of different extraction methods

由表5可知，超声波辅助提取法较乙醇提取法，花青素得率提高了0.37倍，提取时间缩短了86.67%，提取温度降低，降低了成本，进一步对得到的花青素进行活性研究。花青素虽有多种生物活性，但是一种不稳定的天然色素[18]，其稳定性受到各种因素的影响，给花青素的保存、开发、利用造成一些不便，可在以后试验中尝试膜过滤等方法提取纯化，其组成成分及含量变化可通过液相色谱质谱联用（liquid chromatograph mass spectrometer，LC-MS）分析鉴定，其单体制备和合成途径等均需进一步探讨。

3.3 抗氧化测定

3.3.1 FRAP法

FRAP法[19]反映的是三价铁离子还原成二价铁离子的能力。紫苏叶花青素和VC的铁离子还原/抗氧化能力见图3。

图3 紫苏叶花青素和VC的铁离子还原/抗氧化能力Fig.3 The ferric reducing/antioxident power of anthocyanins from Perilla frutescens leaves and VC

由图3可知，在测定浓度范围内，紫苏叶花青素粗提物具有一定的铁离子还原/抗氧化能力，抗氧化能力随样品的质量浓度的增加而增强，VC对Fe3+还原能力明显强于紫苏叶花青素粗提物。紫苏叶花青素抗氧化活性与其化学结构组分有关系，改变芳香环上的基团种类及位置，抗氧化性随之改变；紫苏叶提取物抗氧化能力小于VC，主要是因为提取物为粗提物，含非活性物质及杂质。

3.3.2 DPPH·清除能力

DPPH·是一种稳定自由基，在517 nm处存在最大吸收值，其吸光值与浓度呈相关关系，当加入自由基清除剂时，未配对电子被配对，自由基被抑制，吸光值会变小，以此来评价自由基清除能力[20]。紫苏叶花青素和VC对DPPH·的清除能力见图4。

图4 紫苏叶花青素和VC对DPPH·的清除能力Fig.4 Scavenging activities of anthocyanins from Perilla frutescens leaves and VCon DPPH·

由图4可知，当质量浓度低于5%时，VC对DPPH·的清除能力随质量浓度的增加而增强，而花青素粗提物对DPPH·清除率缓慢增强；当质量浓度继续增大，清除率趋于平缓，这与蒋其忠[21]和王彦平[22]中的结果趋势一致。VC清除DPPH·能力明显高于花青素粗提物，这一结果与FRAP法结果相对应。

3.3.3 ·OH清除能力

·OH是迄今所知生物体毒性最强、危害最大的一种重要的活性氧自由基，几乎可以和所有的细胞组分反应。紫苏叶花青素和VC对·OH的清除能力见图5。

由图5可知，紫苏叶花青素粗提物对·OH具有一定的清除能力，在测定范围内，其浓度与清除率呈正相关关系，VC对·OH清除能力大于同浓度下紫苏叶粗提取物。

图5 紫苏叶花青素和VC对·OH的清除能力Fig.5 Scavenging activities of anthocyanins from Perilla frutescens leaves and VCon·OH

3.3.4 O2-·清除能力

O2-·是人体内产生的活性氧自由基，可在短时间内引发自由基链式反应，能引发体内脂质过氧化，加快机体的衰老，危害人体健康。紫苏叶花青素和VC对O2-·的清除能力见图6。

图6 紫苏叶花青素和VC对O2-·的清除能力Fig.6 Scavenging activities of anthocyanins from Perilla frutescens leaves and VCon O2-·

由图6知，紫苏花青素粗提物对O2-·有一定的清除能力，同浓度下，清除能力低于VC，清除O2-·能力强于·OH能力，说明其对不同自由基的清除具有选择性，可以有针对性的清除某种自由基，提高清除能力。

表6 不同浓度紫苏叶花青素粗提物的抑菌情况Table6 The antibacterial situation on different concentrations of anthocyanins from Perilla frutescens leaves

3.4 紫苏叶花青素抑菌性测定

不同浓度紫苏叶花青素粗提物的抑菌情况见表6。

采用打孔法观察体外抑菌活性，发现抑菌圈直径大小不一。不同浓度紫苏叶花青素粗提物对不同的菌株均有一定的抑制效果，紫苏叶花青素粗提物对大肠杆菌的抑菌效果最好，对腐败希瓦氏菌的抑菌效果最差。紫苏叶花青素粗提物对供试菌的MIC及MBC见表7。

表7 紫苏叶花青素粗提物对供试菌的MIC及MBCTable7 The effect of anthocyanins from Perilla frutescens leaves on MIC and MBC of tested bacteria

紫苏叶花青素粗提物的MIC值越小，其抑菌性越强，抑菌效果越好。由表7知，紫苏叶花青素粗提物在浓度为5 mg/mL对4种菌均具有抑制效果，对大肠杆菌的抑制效果较强，其MIC和MBC分别为1.25 mg/mL和2.5 mg/mL，对金黄色葡萄球菌和荧光假单胞菌的抑制效果相当，其MIC和MBC分别为2.5 mg/mL和5 mg/mL，对腐败希瓦氏菌的抑菌效果最差。花青素对某些细菌抑制方面有一定潜能，而其抑菌和杀菌机理还有待进一步考证。

4 结论

乙醇提取法提取紫苏叶花青素最佳条件为2.5%HCl-60%乙醇60℃提取2.5 h，得率为4.003 mg/100 g；超声波辅助提取法紫苏叶花青素最佳提取工艺为超声功率 450 W，超声时间 20 min，料液比 1 ∶40（g/mL），超声温度40℃，得率为5.489 mg/100 g；超声辅助提取法较乙醇提取法，花青素得率提高了0.37倍，提取时间缩短了86.67%，提取温度降低，降低了成本。通过检测FPAR法，发现紫苏叶花青素具有较强的铁离子还原氧化能力，此外紫苏叶花青素对DPPH·、·OH、O2-·有特定的清除能力，因此花青素具有一定的抗氧化能力。不同浓度紫苏叶花青素粗提物对不同的菌株均有一定的抑制性能，对大肠杆菌有较好的抑制作用，其MIC和MBC分别为1.25 mg/mL和2.5 mg/mL，对腐败希瓦氏菌的抑制作用不明显。