UNBS5162对脑胶质瘤细胞增殖和转移的抑制作用及机制

刘 冰 霍会永 冯社军 曹 凌 赵 现 曹 妍 薛 靖 王如科 李军涛

目前，脑胶质瘤的治疗仍是医学上的一个难题，现阶段主要以手术切除为主，术后辅以放疗和化疗，但总体治疗效果不理想，主要是由于恶性胶质瘤的侵袭性行为导致肿瘤无法全切以及脑胶质瘤固有的对化疗及放疗的抗性造成[1]。萘酰亚胺类化合物是一种DNA嵌入剂，具有良好的抗肿瘤活性[2]。UNBS5162是一种特殊的萘二甲酰亚胺，能减少前列腺癌中趋化因子配体[chemokine (C-X-C motif) ligand，CXCL]表达[3]，对体内、外多种肿瘤细胞的增殖具有良好的抑制作用[4]。本研究通过体外实验，观察UNBS5162对脑胶质瘤细胞U251增殖、迁移和侵袭的抑制作用，通过检测细胞凋亡相关蛋白[B淋巴细胞瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)、B淋巴细胞瘤-2相关蛋白(Bcl-2-associated X protein，Bax)、活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)]及磷脂酰肌醇激酶(phosphoinositide 3-kinase，PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B，AKT)信号通路相关蛋白[AKT、哺乳动物雷帕霉素靶向基因(mammalian target of rapamycin，mTOR)、70S核糖体蛋白S6激酶(ribosomal protein S6 kinase beta-1，p70S6K)]的表达情况，探讨UNBS5162对脑胶质瘤细胞的抗肿瘤作用及机制，为研究高效、低毒的抗肿瘤药物提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 脑胶质瘤细胞U251(上海中科院细胞库)，HY-16509 UNBS5162 (美国MCE公司)，RPMI-1640培养液(美国HYCLONE公司)，血清(美国Gibco公司)，双抗(美国SIGMA公司)，0.25%胰酶消化液[加乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA)]购于北京索莱宝公司，RIPA(radio immunoprecipitation assay)蛋白裂解液、BCA(bicinchoninic acid)蛋白定量试剂盒、蛋白酶抑制剂混合物(北京康为世纪生物科技有限公司)，Transwell小室(美国Millipore公司)，CCK8-kit(北京索莱宝公司)，Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒(北京四正柏公司)，一抗(兔抗人)AKT、p-AKT、mTOR 、p-mTOR(美国CST)，p70S6K、Bcl-2、Bax、活化的Caspase-3、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)、辣根过氧化物酶(horseradish Peroxidase，HRP)标记的羊抗兔/羊抗鼠二抗(美国PTG)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 采用含有10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和0.1 mg/mL链霉素的RPMI-1640培养液培养脑胶质瘤细胞U251，置于37℃、5%CO2培养箱内常规培养。待细胞进入对数生长期，用PBS清洗3次，经胰酶消化，细胞变圆后，加入培养液终止消化，反复吹打为单细胞悬液，种植到6孔板中进行后续实验。UNBS5162处理的细胞作为实验组(UNBS5162)，二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)处理的细胞作为对照组。

1.2.2 CCK8增殖检测 将对数生长期U251细胞消化计数，取悬液100 μL，以每孔1 000个细胞的标准种到96孔板中，每组设置5个复孔。对照组加1‰ DMSO，实验组加入UNBS5162，于CO2培养箱中常规培养，每隔24 h检测1次细胞活力，检测前，每孔加10 μL CCK8试剂，37℃培养箱中孵育1.5 h，450 nm酶标仪检测吸光度A值，以A450值间接反映细胞存活数量和增殖能力。

1.2.3 Transwell侵袭和迁移实验 侵袭实验：采用Transwell小室法构建侵袭模型，将提前过夜融化的Matrigel基质胶100 μL(无血清培养液按1∶6稀释)加入到24孔板的Transwell上室中，于37℃、CO2培养箱中静置4～6 h成胶，吸干培养液，下室中加500 μL无血清培养液，静置30 min,水化基底膜。用无血清RPMI-1640制备细胞悬液，将100 μL细胞悬液(1×105个)加入上室中，下室中加入500 μL完全培养液。过夜，取出小室，棉签擦掉上室中残余的细胞，PBS清洗，4%多聚甲醛固定30 min。0.1%结晶紫染色20 min，PBS清洗后，显微镜下随机选取5个视野，拍照观察计数。

迁移实验：步骤类似侵袭实验，Transwell小室无需 Matrigel基质胶处理，加入Transwell上室中的细胞数目调整为5 000个。

1.2.4 流式细胞仪检测细胞凋亡 采用10 μmol/L UNBS5162处理细胞24 h为实验组，对照组细胞为DMSO处理，更换成无血清培养基，常规条件下，饥饿培养24 h。收集实验组以及对照组细胞进行离心(1 000 r/min，5 min)，4℃预冷的PBS洗2次，加入缓冲液重悬细胞，调节细胞密度为(1～5)×106/mL。取100 μL细胞悬液于5 mL流式管中，加入5 μL 细胞凋亡检测试剂Annexin V-FITC于室温避光孵育5 min。加10 μL碘化丙啶(propidium Iodide，PI)染液与400 μL PBS，进行检测。采用FlowJo软件对流式结果进行分析处理。

1.2.5 蛋白免疫印迹检测(Western blot) U251细胞经10 μmol/L UNBS5162处理24 h后，RIPA裂解细胞提取细胞总蛋白，BCA法测定其浓度。每个样本取20 μg蛋白通过10%聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)进行分离，转膜后，5%脱脂奶粉封闭1 h，加入兔抗人Bcl-2、Bax、活化的Caspase-3、AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR、p70S6K(一抗浓度1∶1 000)4℃孵育过夜，采用TBST(tris buffered saline tween)缓冲液清洗3次，每次5 min，加入HRP标记的羊抗兔/羊抗鼠二抗室温孵育1 h，洗膜后，加增强化学发光试剂(enhanced chemiluminescence，ECL)显影。QUANTITY ONE 软件扫描灰度值，以GAPDH为内参，以目的蛋白灰度值/内参灰度值形式计算各蛋白的相对表达量。

2 结果

2.1 UNBS5162对U251细胞增殖的影响 10 μmol/L UNBS5162处理细胞24 h后，CCK8实验结果表明，实验组吸光度值低于对照组(P<0.05)；继续培养48 h和72 h后，U251细胞增殖能力依然低于对照组(P<0.05)。详见表1。

表1 UNBS5162对U251细胞增殖的影响(吸光度A值，

2.2 UNBS5162对U251细胞侵袭和迁移的影响 10 μmol/L UNBS5162处理细胞24 h后，Transwell实验显示，与对照组相比，实验组细胞侵袭数减少[(18±5)个 比 (32±2)个，t=4.503，P=0.011]，实验组细胞迁移数也同样降低[(30±2)个 比 (78±4)个，t=18.590，P<0.001]。详见图1。

图1 UNBS5162对 U251细胞迁移和侵袭的影响

注：A为对照组侵袭细胞；B为实验组侵袭细胞；C 为对照组迁移细胞；D为实验组迁移细胞

2.3 UNBS5162对U251细胞的凋亡的影响 与对照组相比，10 μmol/L UNBS5162处理细胞24 h后，实验组U251细胞凋亡率增加[(24.46±2.03)% 比 (5.75±0.74)%，t=14.998，P<0.001)。Western blot实验显示，与对照组相比，UNBS5162处理后U251细胞中Bcl-2表达量下降[(0.36±0.032) 比 (1.00±0.043)，t=20.681，P<0.001]，而Bax和活化的Caspase-3表达量均上升[(1.69±0.141) 比 (1.00±0.067)，t=7.689，P=0.002；(1.35±0.066) 比 (1.00±0.055)，t=7.056，P=0.002]。详见图2。

图2 UNBS5162对U251细胞凋亡的影响

注：A为流式细胞检测细胞凋亡；B为Western blot检测凋亡相关蛋白

2.4 UNBS5162对U251细胞中PI3K/AKT信号通路的影响 Western blot实验显示，与对照组相比，实验组细胞中AKT和mTOR的磷酸化水平(p-AKT、p-mTOR)受到抑制[(0.654±0.097) 比 (1.000±0.084)，t=4.670，P=0.009；(0.599±0.070) 比 (1.000±0.098)，t=5.767，P=0.004]，其下游细胞增殖相关蛋白p70S6K表达水平也相应降低[(0.703±0.094) 比 (1.000±0.108)，t=3.593，P=0.023]。详见图3。

图3 UNBS5162处理对PI3K/AKT 通路关键蛋白表达的影响

3 讨论

作为抗肿瘤药物，萘酰亚胺类化合物作用显著，不仅能嵌入DNA，抑制DNA和RNA的合成，同时也能抑制拓扑异构酶，己成为近几年研究的热点之一[5-7]。UNBS5162是一种特殊的萘酰亚胺衍生物，目前研究多集中于其在肿瘤新血管生成和细胞自体吞噬中的作用[8-10]，而对于UNBS5162在肿瘤细胞抑制作用方面研究较少。本研究中，采用10 μmol/L UNBS5162处理胶质瘤细胞U251后，通过CCK8实验检测发现，UNBS5162能够显著降低U251细胞增殖能力，其表现的抑制肿瘤细胞增殖能力与前人在其他肿瘤中的实验结果相似[11]。另外，本研究通过Transwell实验检测还发现，UNBS5162处理后U251细胞迁移和侵袭数显著低于对照组，表明UNBS5162还能够抑制U251细胞迁移和侵袭能力。以上结果提示UNBS5162对胶质瘤细胞生长和转移具有一定的抑制作用。近些年，随着分子生物学和细胞生物学的迅速发展，以及对细胞凋亡现象、细胞凋亡相关蛋白和细胞凋亡相关疾病的广泛深入的研究，人们已经对细胞凋亡的信号传导通路有了一定程度的了解。本研究发现，UNBS5162能促进U251细胞凋亡，导致U251细胞中抗凋亡蛋白Bcl-2表达量下降，促凋亡蛋白Bax、活化的Caspase-3表达量上升，提示UNBS5162可通过诱导凋亡相关蛋白的变化促进胶质瘤细胞凋亡。结合前人研究[11]，本研究认为UNBS5162可作为一个潜在的抗肿瘤试剂用于抑制胶质瘤生长和转移。

胶质瘤的发生涉及多种原癌基因和抑癌基因的结构与功能异常，是一种多基因异常疾病。PI3K/AKT信号转导通路在胶质瘤的增殖、转移、血管生成及对放化疗药物的耐药等细胞活动中起重要作用[12-15]。AKT可调节众多生物学事件，如生存和凋亡、转录、翻译、侵袭和迁移、细胞周期调控、血管生成和端粒的维持。mTOR是一种不典型的丝氨酸/苏氨酸激酶，能磷酸化AKT的第473位丝氨酸并使之活化，进而激活AKT的活性。AKT也可通过磷酸化mTOR的Ser-448 位点而激活mTOR，mTOR可磷酸化下游分子核糖体蛋白p70S6K，进而激活其促进细胞增殖等相关功能，促进蛋白质的合成，与肿瘤发展进程密切相关[16-18]。本研究通过Western blot检测发现，UNBS5162能抑制U251细胞中AKT和mTOR的磷酸化水平，且下游细胞增殖相关蛋白p70S6K表达水平也相应降低。以上结果有力地证明了UNBS5162对脑胶质瘤细胞的抑制作用与PI3K/AKT信号通路的激活有关。

综上所述，UNBS5162对脑胶质瘤细胞U251的增殖、迁移和侵袭具有显著抑制作用，能够促进胶质瘤细胞U251凋亡，其分子机制可能与UNBS5162抑制PI3K信号通路的激活有关。