针刺捻转补泻手法对SHR海马Ach、M1含量的影响*

杨芳媛 刘清国

（北京中医药大学，北京 100029）

随着经济社会的发展，高血压的发病率持续升高，并呈年轻化趋势[1]。高血压除了带来沉重的社会与家庭负担外，也对个人产生了身心方面的压力。高血压属最常见的慢性病之一，如发病年龄越小，其病程越长，对心、脑、肾及血管等的不利影响也愈加严重[2]。除此之外，高血压还会诱发其他疾病的发生发展。

海马在学习[3]、记忆力[4]、认知[5]、注意力[6]、精神情绪调节[7]、空间定位方面有重要的作用，对海马进行刺激后会影响外周自主神经的活动，外周传入的信息也会作用于它，海马是组成中枢自主神经活动调控系统的重要部分。研究发现：捻转补泻手法对应激性高血压大鼠下丘脑中NOS-1基因和蛋白表达有影响；可以通过Ach-NO-cGMP信号转导通路调控血压。本研究在已有研究的基础上，以自发性高血压大鼠（SHR）[8]模型为研究平台，分析探讨捻转补泻手法对SHR的海马区的效应及机制，并通过RT-PCR及ELISA方法检测海马区间乙酰胆碱（Ach）、毒蕈碱型受体（M1），分析捻转补泻手法对海马区神经递质的影响为以后补泻手法的机制研究提供思路和线索，为探索新的高血压防治靶点提供理论依据，为提升高血压防治有效率提供可靠的技术方法。现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级，SHR40只，WKY大鼠10只雄性，9周龄，体质量（210±15）g，实验动物均购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：SCXK（京）200223。实验中使用的动物饲养于北京中医药大学针灸推拿学院针灸生物学实验室（国家二级实验室）。实验期间，室温控制在（20±1）℃，湿度控制在50%左右，饮食饮水自由，紫外线定期消毒，定期更换饲料、垫料、水。实验中使用的大鼠饲料、垫料均由北京维通利华公司提供。实验中所有程序均遵守动物实验国际伦理准则，并且得到了北京中医药大学动物保护与使用委员会的批准（批准号：BUCM-3-2016090301-3003）。

1.2 试药与仪器

中研太和牌针灸针（规格：直径0.18 mm，长度13 mm，北京中研太和医疗器械有限公司），BP-6无创血压仪（成都泰盟科技有限公司），一次性注射器（山东颐兴医疗器械有限公司），ACS-XM计重电子秤 （上海升亮电子科技有限公司），医用棉球（扬州亚申科技有限公司），纱布块（江西康卫器械设备有限公司），全自动多功能酶标仪（MULTISKAN MK3，Thermo，USA），电热恒温培养箱（DH4000A，天津泰斯特），MINI shaker（MH-1，kylin-Bell Lab Instruments QILINBEIER），高速冷冻离心机（Beckman Allgre 21R），电泳仪（北京六一仪器厂），电泳槽 （北京君意东方电泳设备有限公司），凝胶成像仪（BioSens SC 810B，上海山富科学仪器有限公司），分光光度计（UV-2000，上海菁华科技有限公司），实时定量 PCR 仪（ABI7500，USA）。

1.3 动物分组

WKY大鼠10只作为空白组对照。SHR经筛选后，随机分为模型组、针刺组、捻转补法组、捻转泻法组，每组10只。

1.4 干预方法

1）空白组与模型组抓取固定不针刺。2）针刺组取“太冲穴”（双侧），取穴参照《实验针灸学》[9]：于后肢足背1、2趾骨间凹陷处取“太冲穴”。只针刺不施行手法。3）捻转补法组：取穴同针刺组。将大鼠固定于鼠套中之后，毫针直刺1～2 mm，留针20 min；予针刺补法：右手为刺手针刺后，施行手法，拇指向前重捻，轻退回。手法幅度为 360°/次，60 次/min，持续捻转 3 min。 4）捻转泻法组：取穴同针刺组。将大鼠固定于鼠套中之后，毫针直刺1～2 mm，留针20 min；予针刺泻法：以右手为刺手针刺后，施行手法，拇指向后重捻，轻退回。手法幅度为 360°/次，60 次/min，持续捻转 3 min。各组治疗 27 d，每隔6 d休息1 d，每日下午治疗1次。所有针刺操作均由同一人完成。

1.5 标本采集与检测

1.5.1 血压测量 将大鼠于36℃下预热约15 min，连续3次测量大鼠尾压，取均值。于开始针刺前1 d测量血压 1次，针刺治疗开始后，于针刺的第 3、8、13、18、23、27日测量血压值。注意：测压过程动作要轻柔，不能激惹大鼠，以免引起血压波动。

1.5.2 实验取材 在实验的第28天下午，将所有大鼠用100 g/L的水合氯醛麻醉后，断头处死，于冰块上取出海马组织，经液氮固定后，放置于-80℃的冰箱进行保存。

1.5.3 ELISA检测Ach 在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。可根据颜色反应的深浅刊物定性或定量分析。

1.5.4 RT-PCR检测M1 合成引物，引物AchRM1R F，引物序列（5′to 3′）为 CCTGCTGTCAGTCCCAACAT；引物 AchRM1R R，引物序列（5′to 3′）为GAGCTCG-GTGTTGACCTTGA。提取样本总RNA，将RNA模板、引物、5xRT mix和RNase-free Water溶解并置于冰上备用，混匀，孵育5 min，迅速冰浴2～10 min，短暂离心，使管壁上的溶液收集到管底。继续向以上反应液中加入试剂5xRT Mix和HiFi-MMLV Enzyme Mix，轻轻吸打混匀，37℃孵育40 min。反应结束后70℃保温10 min。用ABI7500荧光定量PCR仪，采用2-△△ct方法进行数据的相对定量分析。

1.6 统计学处理

2 结 果

2.1 各组大鼠收缩压比较 见表1。针刺前，空白组的血压与模型组、针刺组、补法组和泻法组之间有明显差异（P＜0.05），4个由SHR组成的组之间无明显差异（P＞0.05）。在实验干预后，组间的差异表现为：空白组和模型组的收缩压均有上升（P＜0.05）；针刺组的收缩压也有上升（P＜0.05），但是比空白组和模型组的升势缓；捻转补法组和捻转泻法组的收缩压呈下降趋势（P＜0.05），且泻法组收缩压下降趋势较补法组更明显（P＜0.05）。组内的差异表现为：从第8日起，空白组、模型组、针刺组、捻转补法组、捻转泻法组与针刺前1 d比较有显著差异（P＜0.05）。

表1 各组大鼠收缩压变化比较（mmHg，±s）

表1 各组大鼠收缩压变化比较（mmHg，±s）

与空白组比较，*P＜0.05；与模型组比较，△P＜0.05；与针刺组比较，▲P＜0.05；与捻转补法组比较，◇P＜0.05

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2.2 各组大鼠海马中Ach、M1表达比较 见表2。针刺干预后，Ach含量空白组与模型组、针刺组、补法组、泻法组之间差异有统计学意义（P＜0.05），模型组与针刺组之间差异无统计学意义（P＞0.05），针刺组与空白组、泻法组之间差异有统计学意义（P＜0.05），泻法组与补法组之间差异有统计学意义（P＜0.05）。M1含量空白组与模型组之间差异有统计学意义（P＜0.05），针刺组与补法组之间差异无统计学意义（P＞0.05），泻法组与补法组、针刺组、模型组之间差异有统计学意义（P＜0.05），泻法组与空白组之间差异无统计学意义（P＞0.05）。

表2 各组大鼠海马中Ach、M1含量变化比较（±s）

表2 各组大鼠海马中Ach、M1含量变化比较（±s）

与空白组比较，*P＜0.05；与捻转补法组比较，△P＜0.05

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3 讨 论

本研究采用SHR作为模型组和干预组，因为SHR的血压升高是由多基因遗传决定的，与人类高血压病十分类似，是研究高血压病发病机制和筛选降压药物较为理想的动物模型。WKY大鼠是自发性高血压大鼠的对照品系，所以选择其作为空白组。

针刺补泻的基本原则见于《灵枢》[10]中“凡用针者，虚则实之，满则泻之，宛陈则除之，邪胜则虚之”。机体可将捻转补泻所产生的不同刺激信号转化为生物学信号，通过神经内分泌、细胞因子、信号转导通路、神经放电等方式参与生命活动的调节。

海马参与血压的调控[11]主要通过两方面进行：一是通过神经递质与神经通路产生联系，调控血压，二是直接与神经通路相关组织发生联系调控血压。海马区的主要神经递质系统[12]有5-HT、Ach等系统以及海马组织自身受体在突触前调制中的作用。与海马区相关的神经通路组织有脑干的孤束核（NTS），其参与调节自主神经系统[13]。NTS是内脏的初级传入中枢与基本反射中枢，多接受来自于心血管、胃肠系统等的信息。海马传出的纤维可以传到PVN、内侧额叶皮质（MFC）等脑区，这些脑区又能直接投射到NTS，所以这些脑区可以算是海马和NTS之间的中继站。海马调控心血管反应可以通过CA1区的神经元投射到MFC，再通过MFC投射到NTS。存在于NTS的胆碱能神经元经多个通路可以投射到海马的CA1区。Ach是中枢胆碱能系统中重要的神经递质之一[14]，中枢能胆碱系统与学习、记忆、血压[15]密切相关。Ach可使全身血管扩张，也包括肺血管和冠状血管[16]。其扩血管作用主要由于激动血管内皮细胞胆碱受体亚型，引起NO释放，NO可以通过通路对心血管活动产生调节作用，抑制交感兴奋性，引起邻近平滑肌细胞松弛，从而降低血压[17]。毒蕈碱型受体是乙酰胆碱的受体，当Ach与这类受体结合后，可产生一系列副交感神经末梢兴奋地效应，包括心脏活动的抑制，胃肠道平滑肌的收缩，以及消化腺分泌增加等。毒蕈碱型受体在中枢主要有3种亚型，在中枢主要分布的是 M1 受体[18]。

在本实验中，针刺前，空白组的血压与模型组、针刺组、补法组和泻法组之间有差异（P＜0.05），4个SHR大鼠组之间无明显差异（P＞0.05）。在实验干预后，组间的差异表现为：空白组和模型组的收缩压均有上升（P＜0.05）；针刺组的收缩压也有上升（P＜0.05）但是比空白组和模型组的升势缓；捻转补法组和捻转泻法组的收缩压呈下降趋势（P＜0.05），且泻法组收缩压下降趋势较补法组更明显。组内的差异表现为：从第8天起，空白组、模型组、针刺组、捻转补法组、捻转泻法组与针刺前1 d比较有显著差异（P＜0.05）。大鼠血压组间的差异显示出针刺捻转补泻手法对血压的调控有明显的作用[19]，其中以捻转泻法的作用更为明显[20]。组内之间的差异是由于每日对其进行抓取固定，这属于一种刺激，会引起大鼠的应激发应，从而造成血压升高。

针刺干预后，Ach含量补法组、针刺组、模型组、空白组之间有差异（P＜0.05），泻法组与模型组之间有差异（P＜0.05），泻法组与补法组、针刺组之间有差异（P＜0.05），模型组与空白组之间有差异（P＜0.05）。 M1含量补法组、针刺组、模型组、空白组之间有差异（P＜0.05），泻法组与补法组、针刺组、模型组之间有差异（P＜0.05）。分析其原因，应该是针刺捻转补泻手法可以增多Ach、M1的释放，通过Ach-M1-抑制NA释放-降低血压，Ach-M1-NO-GCMP-降低血压这两条通路来进行血压的调控。

综上所述，通过针刺“太冲”穴，并施加捻转泻法的干预，自发性高血压大鼠的血压明显降低。实验大鼠经过针刺捻转补泻手法刺激后，海马组织中Ach、M1的含量均升高，针刺捻转泻法可促进SHR大鼠海马组织内降压神经递质的生成，通过升高自发性高血压大鼠Ach、M1、NO的含量，可激活鸟苷酸环化酶，使钙离子水平降低，导致血管紧张性降低，达到降压的目的。