脱氢表雄酮对高脂诱导的人脐静脉内皮细胞MMP-2表达的影响及CYP19在其中的作用

周颖，李桃，肖芳，黄江梅，赵敏

(秦皇岛市第一医院，河北秦皇岛066000)

动脉粥样硬化是一种常见病、多发病。研究显示，雌激素具有抗动脉粥样硬化作用，但用其治疗可引起乳腺及子宫病变。雄激素可通过被细胞降解为雌激素后发挥抗动脉粥样硬化作用，但雄激素可引起前列腺肥大等不良反应。脱氢表雄酮(DHEA)是一种弱的雄激素，多数研究认为DHEA有抗动脉粥样硬化的作用[1，2]，目前国外已将DHEA补充治疗应用于临床。DHEA在体内主要通过转化为雌酮而发挥作用，细胞色素P450芳香酶(CYP19)是DHEA转化为雌酮的关键酶，增强血管壁细胞内CYP19的表达，可以特异性地加强DHEA在血管局部的抗动脉粥样硬化作用。基质金属蛋白酶-2(MMP-2)是基质金属蛋白酶家族成员之一，在动脉粥样硬化形成过程中发挥重要作用[3，4]。2017年8～12月，我们观察了DHEA对高脂诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)中MMP-2表达的影响，并通过转染含有CYP19基因的质粒，观察DHEA抗动脉粥样硬化作用的效果以及CYP19在其中的作用。

1 材料与方法

1.1 HUVEC的原代培养 无菌条件下取分娩4 h内健康新生儿脐带，采用胰酶消化法从脐静脉获取内皮细胞。用含15%胎牛血清、50 μg/mL内皮细胞生长因子的M199培养基(Gibco公司)培养HUVEC，用0.1%胰蛋白酶传代。

1.2 HUVEC分组与处理 将生长良好的细胞换用无血清DMEM/F12培养基，培养12 h后，分为4组。正常对照组予以DMEM/F12培养基；ox-LDL组予以DMEM/F12培养基+30 mg/L ox-LDL；DHEA组予以DMEM/F12培养基+1 μmol/L DHEA；ox-LDL+DHEA组予以DMEM/F12培养基+30 mg/L ox-LDL+1 μmol/L DHEA。各组HUVEC均作用24 h。

1.3 HUVEC中MMP-2 mRNA表达检测 采用实时荧光定量PCR法。用TRIzol一步法提取各组细胞总RNA，逆转录合成cDNA。将获得的cDNA按照实时荧光定量PCR试剂盒说明书方法扩增目的基因。MMP-2上游引物：5′-TACGATGATGACCGCAAGT-3′，下游引物：5′-AGTCCGCCAAATGAACC-3′；GAPDH上游引物：5′-GCTGGGGCTCACCTGAAGGG-3′，下游引物：5′-GGATGACCTTGCCCACAGCC-3′。扩增条件：95 ℃ 3 min ；94 ℃ 20 s，58 ℃ 20 s， 68 ℃ 20 s，40个循环。以GAPDH作为内参照，采用2-ΔΔCt法计算目的基因表达的相对量，实验重复3次。

1.4 HUVEC中MMP-2蛋白表达检测 采用ELISA法。取各组细胞，加入1 mol/L NaOH裂解，用Lowry法进行蛋白定量。向细胞中加入4%多聚甲醛固定，正常血清封闭，加羊抗人MMP-2多克隆抗体(1∶400)，4 ℃孵育48 h，使用兔抗羊SP试剂盒检测MMP-2蛋白。用酶标仪在490 nm下检测各孔细胞的吸光度A值。用细胞A值与细胞蛋白含量的比值表示MMP-2蛋白的相对表达量。

1.5 HUVEC细胞CYP19基因的转染 将HUVEC接种于6孔板中，M199+15%胎牛血清培养基培养24 h，待细胞融合达80%～90%时应用脂质体LipofectamineTM2000进行CYP19基因体外质粒转染。分别取无血清DMEM/F12培养基250 μL于两只洁净的EP管中，各加入4 μg DNA及8 μL LipofectamineTM2000，混匀室温静置5 min后将两者混合，室温放置20 min后移至6孔板中，6 h后移去培养液，更换为M199+15%胎牛血清培养基培养。

1.6 CYP19基因转染细胞的分组 将转染后的HUVEC用M199+15%胎牛血清培养基培养48 h后，更换无血清DMEM/F12培养基培养2 h，然后分组：①CYP19组：转染CYP19的HUVEC+无血清DMEM/F12培养基；②CYP19+ox-LDL组：转染CYP19的HUVEC+无血清DMEM/F12培养基+30 mg/L ox-LDL；③CYP19+ox-LDL+DHEA组：转染CYP19的HUVEC+无血清DMEM/F12培养基+30 mg/L ox-LDL+1 μmol/L DHEA；④空质粒组：转染空质粒的HUVEC+无血清DMEM/F12培养基；⑤空质粒+ox-LDL组：转染空质粒的HUVEC+无血清DMEM/F12培养基+30 mg/L ox-LDL；⑥空质粒+ox-LDL+DHEA组：转染空质粒的HUVEC+无血清DMEM/F12培养基+30 mg/L ox-LDL+1 μmol/L DHEA。均培养24 h。

1.7 转染细胞MMP-2 mRNA和蛋白表达检测 采用实时荧光定量PCR检测各组转染细胞MMP-2 mRNA的表达，方法同1.3；用ELISA法检测各组转染细胞MMP-2蛋白的表达，方法同1.4。

2 结果

2.1 各组HUVEC中MMP-2 mRNA及蛋白表达比较 见表1。ox-LDL组MMP-2 mRNA及蛋白表达高于正常对照组，ox-LDL+DHEA组较ox-LDL组降低(P均<0.05)，DHEA组与正常对照组比较差异无统计学意义(P均>0.05)。

表1 各组HUVEC中MMP-2 mRNA及蛋白表达比较

注：与ox-LDL组比较，*P<0.05；与ox-LDL+DHEA组比较，#P<0.05。

2.2 各组转染细胞MMP-2 mRNA及蛋白表达比较 CYP19+ox-LDL+DHEA组MMP-2 mRNA及蛋白的表达与空质粒+ox-LDL+DHEA组相比均降低(P均<0.05)，CYP19组与空质粒组MMP-2 mRNA及蛋白的表达均无统计学差异(P均>0.05)，CYP19+ox-LDL组与空质粒+ox-LDL组MMP-2 mRNA及蛋白表达均无统计学差异(P均>0.05)，CYP19+ox-LDL组MMP-2 mRNA及蛋白表达均高于CYP19组(P均<0.05)，CYP19+ox-LDL+DHEA组MMP-2 mRNA及蛋白表达与CYP19+ox-LDL组相比均降低(P均<0.05)。见表2。

表2 各组转染细胞中MMP-2 mRNA及蛋白表达比较

注：与CYP19+ox-LDL组比较，*P<0.05；与CYP19+ox-LDL+DHEA组比较，#P<0.05。

3 讨论

动脉粥样硬化是心脑血管疾病的病理基础，是由多因素参与的复杂的慢性病理过程。MMP-2能分解细胞外基质和基底膜，影响内皮细胞、血管平滑肌细胞及单核细胞的黏附、迁移、增殖等，广泛参与动脉粥样硬化的发生发展过程[5]。近年研究发现，性激素对动脉粥样硬化具有一定的影响[6]。在老年男性和更年期妇女，高水平的DHEA与颈动脉内膜-中膜厚度呈负相关，提示DHEA与老年人颈动脉粥样硬化的危险性呈负相关。沈忠海等[7]研究认为，DHEA是冠心病发病的影响因子。叶漫湘[8]发现，DHEA联用辛伐他汀可改善动脉粥样硬化。Bednarek等[9]报道，DHEA可以减少高胆固醇喂饲兔的动脉壁脂纹面积。

MMP-2又称明胶酶A，它表达广泛，能够降解明胶、多种胶原和基底膜成分[10]。MMP-2通过降解包绕中层平滑肌的细胞外基质，促进血管中层平滑肌细胞向内膜迁移，参与了内膜的增生，为形成动脉粥样硬化斑块提供条件。动脉粥样硬化发生时，ox-LDL等因素诱导内皮细胞分泌MMP-2降解基底膜，有利于单核细胞入侵；循环中的单核细胞与内皮细胞黏附时，一方面，单核细胞的黏附促进内皮细胞分泌MMP-2，另一方面，分泌的MMP-2反过来又促进单核细胞在血管壁中的迁移，从而加速动脉粥样硬化的发展[11]。MMP-2还可通过降解细胞外基质削弱斑块表面纤维帽成分，使斑块易于发生破裂[12]。MMP-2在动脉粥样硬化中的作用越来越受到人们关注，甚至被认为是治疗动脉粥样硬化及防治并发症的靶分子。本研究结果显示，ox-LDL+DHEA组MMP-2 mRNA和蛋白表达较ox-LDL组降低，提示DHEA能特异性抑制ox-LDL诱导的HUVEC MMP-2的表达，其机制可能与DHEA发挥抗动脉粥样硬化作用有关。

DHEA在体内主要通过转化为雌酮而发挥作用，而CYP19是DHEA转化为雌酮的关键酶[13，14]。CYP19是细胞色素P450家族成员之一，普遍存在于细胞中[15]。Marder等[16]研究认为，DHEA在细胞内主要被CYP19降解而进一步发挥作用。Yoneyama等[17]发现，DHEA的抗血管内皮细胞增生作用是通过CYP19降解为雌激素而发挥的。Hayashi等[18]通过给予切除卵巢后的白兔不同饮食来研究DHEA抗动脉粥样硬化的机制，结果表明DHEA的抗动脉粥样硬化作用是通过CYP19转化为雌二醇而发挥的，并且雌二醇的抗动脉粥样硬化作用可能是通过NO发挥的。过表达CYP19基因能够增强DHEA抑制高脂诱导的MMP-2表达的作用，从而增强DHEA的抗动脉粥样硬化作用。本研究将CYP19和空质粒分别体外转染至HUVEC，之后给予ox-LDL诱导及DHEA干预，结果显示，CYP19+ox-LDL+DHEA组MMP-2 mRNA及蛋白的表达与空质粒+ox-LDL+DHEA组相比均明显降低。表明过表达CYP19基因使DHEA大量转化为雌酮，进而抑制高脂诱导的MMP-2表达，从而发挥抗动脉粥样硬化的作用。

综上所述，DHEA能够抑制高脂诱导的MMP-2表达，这可能是其发挥抗动脉粥样硬化作用的机制之一；过表达CYP19能够增强DHEA的这一作用。